Xylulose
3.06.4.1.1 Saccharomyces yeast
初期の研究により、Saccharomyces yeastは効率的ではないけれど、キシルロースをエタノールに発酵できることが分かっている。 したがって、理論的には、サッカロミセス酵母はキシロースをキシルースに変換する酵素を欠いているだけである。 前述のように、細菌は補酵素を必要としない単一の酵素でキシロースをキシルロースに変換する（図3）。 一方、酵母のキシロースからキシルロースへの変換系では、上記のように代謝的に理想的とはいえない2つの酵素が必要であった。 当初、世界中の10近い研究室が、細菌由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子を酵母にクローニングすることを試みていた。 大腸菌のキシロースイソメラーゼ遺伝子のクローニングを最初に達成したのは、パデュー大学のHoらのグループであった。 しかし、クローニングされた菌体遺伝子が酵母で合成したタンパク質にはキシロース異性化酵素活性がなかった
第2の方法は、P. stipitisのXRとXD遺伝子をSaccharomyces酵母にクローニングすることであった。 しかし、これらの酵素の動力学と反応の熱力学的平衡は、エタノールではなくキシリトールの生産に有利であった。 1990年代初頭、3つのグループ（デュッセルドルフ大学のKotter、Ciriacyら、大阪大学のTantirungkijら、ルンド大学のHahn-Hägerdalら）が、XRとXD遺伝子をSaccharomyces酵母にクローニングして、キシロースを発酵させることに成功したことを報告した。 しかし、これらのグループが開発した組換え酵母は、キシロースの発酵が極めて遅く、エタノールの生産も少なく、主な代謝産物はキシリトールであった。
Hoグループは、P. stipitis由来のXRおよびXDとともに、本来のキシロキナーゼ（XK）を過剰発現させると、細胞内のキシロース濃度が下がりエタノールへの代謝フラックスが良くなると仮定し、キシロースが細胞内に存在し、エタノールへの代謝フラックスが良くなると考えた。 キシルロキナーゼはエタノール生産に向けた不可逆的反応を触媒するため（図3）、キシルロキナーゼ活性が高ければ、キシルロース濃度は低くなる。 これは、XD触媒反応の平衡がキシリトールを優先し、代謝フラックスをエタノール生産の方向に向けるためには、低い定常状態のキシルロース濃度が必要であるため、望ましいことである。 さらに、これら3つの遺伝子をクローニングすることで、細胞内での発現を制御することが可能になった。 細胞本来の発現制御系では、これらの遺伝子の発現はキシロースの存在下で誘導され、グルコースで阻害される。 この組換え酵母は、グルコースとキシロースを同時に発酵させることができ、グルコースとキシロースの発酵の間に長いラグがなく、エタノールの工業生産に非常に望ましいと考えられる。 その後、Hoグループは、XR、XD、XK構造遺伝子の上流のDNA配列を、有効な構成的プロモーターを含む解糖系遺伝子の上流配列に置き換えた。 得られたXR、XD、XK遺伝子を高コピー数2μのプラスミドにクローニングし、得られたプラスミドpLNH32を用いて、デンプン（グルコース）を原料とするエタノール生産に優れた工業用サッカロミセス酵母の野生型株を形質転換することに成功した。 1993年、同グループは、高濃度のキシロースをほぼ完全にエタノールに発酵させ、副産物としてほとんどキシリトールが得られない組換えSaccharomyces酵母1400（pLNH32）の開発に成功したことを報告した。 さらに、この酵母はグルコースとキシロースを共発酵させ、グルコースよりもキシロースの発酵速度が遅いものの、これら2糖の発酵の間にあまりラグがない状態でエタノールにすることができた（図4）。 その後、1400型（pLNH 32）の構築と開発の詳細が報告された 。 その後もHoグループは、以下に述べるような様々な新しいアプローチでこの酵母の改良を続けている。 (左）XR、XD、またはXK遺伝子を含まないか、またはXRとXDのみを含みXKを含まないpLNH32の親プラスミドで形質転換したサッカロミセス酵母株1400は、グルコースとキシロースの混合物の発酵に使用された。 (右）クローン化したXR、XD、XK遺伝子を含むプラスミドpLNH32で形質転換した1400酵母。 この酵母を用いて、左図に記載した結果と同一の条件でグルコースとキシロースを発酵させた。 これらのプラスミドにクローニングされた遺伝子は、文献9に記載されたものと同一に改変、構築された。
クローニングされたXR-XD-XK遺伝子を含む2μプラスミド、pLNH32は産業野生型サッカロミセス酵母を含むあらゆるサッカロミセス酵母株をトランスフォームできるように設計したブロードホストプラスミドである。 このようなプラスミドは、セルロース系エタノールの生産に適した宿主のスクリーニングに利用することができる。 また、Hoグループは、酵母の染色体に複数の遺伝子を複数コピーで効率的に組み込むことができる独自の新しい遺伝子組込み技術を開発した。 この技術は簡単に実行でき、統合プラスミド上にクローニングされ宿主酵母細胞に形質転換された遺伝子は、希望する数だけ宿主ゲノムに統合され、最高の活性が得られることがほぼ保証されている（図5）。 この統合技術を利用して、まずXR-XD-XK遺伝子をカセットとして一緒に酵母の染色体に、得られた酵母が最高の効率でキシロースを発酵するまで十分なコピーで統合し、安定なキシロース発酵1400株、1400 (LNH-ST) を開発した (図6)。 Hoグループが開発した現在の最良株である424A（LNH-ST）は、まず10種類のSaccharomyces酵母から2μプラスミドpLNH32で各株を形質転換し、これらの株がpLNH32の存在下でキシロースを発酵するだけでなくグルコース／キシロースの共発酵も効率的に行えることを確認し、次にこの新しい統合技術によって「安定酵母」を開発すべく選択した酵母株の染色体に遺伝子統合を行い、スクリーニングしたものである。 424A（LNH-ST）によるグルコース／キシロースの共発酵を図7に示す。
Figure 5. Hoらに記載された方法によるサッカロミセス酵母259株の染色体へのXR-XD-XK遺伝子の複数コピーの段階的な組み込みの実証． 統合の異なる段階にある酵母を用い、同一条件下でグルコースとキシロースを発酵させ、これらの遺伝子の統合の進行状況を示した： a) 統合初期段階、 b) 25% 完了、 c) 50-75% 完了、 d) 統合の完了後。 統合の完了は、統合過程の細胞が十分長い期間同じ発酵結果を出すことで反映される。
図6. Hoらの方法により酵母の染色体にXR-XD-XK遺伝子を複数コピー組み込んだ1400（LNH-ST）によるグルコースとキシロースの共発酵.
図7.酵母の染色体に複数コピー組み込んだLNH-STによるグルコースとキシロースの共醗酵 Hoらの方法による酵母染色体にXR-XD-XK遺伝子を複数コピー組み込んだサッカロミセス424A株（LNH-ST）によるグルコースとキシロースの共発酵 . 2007年以前にパデュー大学で開発され、現在セルロース系エタノール生産のために産業界に提供されている最高のホーパデュー酵母である。
エタノール生産のような大規模産業生産に組み換え微生物を用いる場合、クローン化する遺伝子をホスト染色体に組み込むことが必要であり、それには二つの重要な理由がある。 一つは、クローン化した遺伝子を確実な方法で宿主染色体に組み込むことができれば、特別な化学物質、培地、抗生物質、添加物などを使用しなくても、クローン化した遺伝子を宿主染色体上に維持することができるためである。 形質を維持するために化学物質や抗生物質を必要とすることは、化学物質のコストを増加させるだけでなく、規制当局の承認プロセスやあらゆる廃液のクリーンアップにコストと困難を伴う。 また、宿主細胞への遺伝子クローニングに用いるpLNH32のようなコピー数の多いプラスミドは、選択的薬剤の存在下でも、大規模な工業的運用を維持することができない可能性がある。 Hoグループは、新しい統合システムを用いて開発した安定酵母1400（LNH-ST）が、パイロットプラントにおいてコーンストーバー加水分解物のエタノールへの連続発酵を維持できること、一方、プラスミド1400（pLNH32）を含む同じ酵母株はそれが不可能であることを明らかにしました。
新しい統合技術によって開発された424A（LNH-ST）株と他の安定株、1400（LNH-ST）および259（LNH-ST）は、すべて他者によって検証され、異なるリグノセルロース系原料の加水分解物を用いたセルロース系エタノール生産に持続的に有効であることが証明されています。 また、424A（LNH-ST）株は、2004年から実証プラントで農業残渣からのセルロース系エタノール生産に工業的に利用されている。
Hahn-Hägerdalが開発した組換え酵母は、パデュー大学のHoグループがキシルロキナーゼ遺伝子のクローニングを行い、この固有遺伝子の発現量が増加するとキシロースからのエタノール収率が向上することを証明するなど、さまざまな追加遺伝子をクローニングして広範囲に改良されている。 工業用エタノール生産酵母であり、広範囲にテストされているため、おそらく成功する可能性が高いでしょう。 最近、パデュー大学のグループは、アラビノースを他の4糖（グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース）と共発酵させたり、エタノールや酢酸への耐性を高めたりして、この株の改良を続けている。
キシロースイソメラーゼを利用したサッカロミセス社のキシロース発酵酵母の開発は、初期の試みは成功せず、XR/XDを利用した有効な人工キシロース発酵酵母が開発されていたが、この経路には酸化還元バランスがないこともあり、長年にわたりキシロースイソメラーゼ利用キシロース発酵酵母の開発への関心が続いている。 2009年、BratらはClosteidium phytofermentans由来のキシロース異性化酵素を用いてキシロース発酵S.Crevisiaeを構築した。 また2009年には、カーギルが、キシロースイソメラーゼを発現し、低pHおよび1%酢酸の存在下でグルコースとキシロースの混合物を効率的に発酵させることができる非サッカロミセス酵母株の開発を報告した。
アラビノースはGAXヘミセルロースとして草のバイオマス中にわずかな量で存在するだけですが、トウモロコシ繊維などのいくつかの特別なバイオマス源は比較的大量のアラビノースを含有していることがあります。 それでも、セルロース系エタノール生産微生物が、セルロース系バイオマスに存在する5つの異なる糖分子すべてを発酵させることができるのが理想的です。 ここでも、酵母のアラビノース代謝のメカニズムは細菌とは異なっている 。 キシロース代謝と同様に、酵母の代謝機構は嫌気性代謝を好まない。 最近、Hahn-Hägerdalらは、キシロースを発酵させるSaccharomyces酵母をさらに操作し、真菌のl-アラビノース経路によってアラビノースをキシロースや他の糖類と共発酵させることに成功した . しかし、この酵母は、アラビノースを発酵させて大量のエタノールを生産することはできないが、少量のアラビノースをアラビトールに変換することができた
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