Abstract

Wnt5aはいくつかの非正規Wntシグナル経路の活性化に関与し、受容体の状況に依存して正規Wnt/βカテニンのシグナル経路を阻害または活性化することが可能である。 Wnt5aシグナルは、幹細胞の自己複製、増殖、分化、移動、接着、極性など、正常な発生過程を制御するために重要である。 さらに、Wnt5aシグナルの異常な活性化や阻害は、癌の進行に重要なイベントとして浮上しており、癌化作用と癌抑制作用の両方を発揮していることが分かっています。 最近の研究では、Wnt5aシグナルが正常および癌幹細胞の自己複製、癌細胞の増殖、遊走、浸潤の制御に関与していることが示されている。 本稿では，胚発生や正常・腫瘍性乳房・卵巣の幹細胞におけるWnt5aシグナルの分子機構と役割に関する最近の知見を概観し，Wnt5aは標的細胞が発現する表面受容体によって異なる影響を及ぼす可能性を強調する

1. はじめに

幹細胞は、胚性幹細胞や成体組織で同定された幹細胞を含め、自己複製能とより分化した子孫を生成する能力を有する。 胚性幹細胞は胚盤胞の内部細胞塊に由来し、多能性であるため、身体のすべての組織を生成することができる。 成体組織の幹細胞は特殊なニッチに存在し、そこで様々な環境および内在性のシグナル入力を統合して、細胞の運命を決定し、組織の恒常性を維持する。

Wnt 因子は、幹細胞ニッチ内で幹細胞に作用して自己再生能力を維持するのを助けるシグナル伝達分子のグループである。 Wnt因子は様々な受容体に結合し、多様な生命活動を制御する正準シグナル伝達経路や非正準シグナル伝達経路を誘導することが知られている。 Wntシグナル伝達経路は、Wnt因子がFrizzledファミリー受容体（Fzd）および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5/6コア受容体（LRP5/6）に結合して複合体を形成することにより開始される。 その結果、Axinとdishevelled（Dvl）が細胞膜に動員され、β-catenin分解複合体が破壊されて、β-cateninが細胞質に蓄積し、核に移動してT-cell factor (TCF)/lymphoid enhancer factor (LEF) familyに結合して、正則Wnt標的遺伝子の転写が活性化される . 一方、いくつかのWnt因子は、Wnt-Ca2+経路または平面細胞極性（PCP）経路として知られるβ-カテニン非依存性経路（非正規Wntシグナル経路）を活性化し、胚発生中の細胞移動を誘導するように働く。

マウスとヒトで19のシステインリッチWntファミリー糖タンパク質の分泌が確認された。 哺乳類の初期胚発生や成体組織の恒常性維持において、これらのWnt因子とその受容体はダイナミックに発現し、適切なシグナル伝達を活性化して、増殖と分化の適切なバランスを確保している。 Wnt因子、その受容体、あるいは下流のシグナル伝達分子の異常な発現によるWntシグナルの撹乱は、いくつかのヒトの癌の発生につながる可能性がある 。 腫瘍の発生能力は、自己複製能と分化能を持つ少数の腫瘍細胞集団に限定されるようであるため、それらはしばしば癌幹細胞（CSCs、または腫瘍発生細胞）と呼ばれる。 さらに重要なことは、胚性幹細胞、正常幹細胞、およびがん幹細胞の生物学は、相互に密接に関連しているということである。 このことは、胚性幹細胞や成体正常幹細胞を規定し維持する分子シグナル（例えば、Wntシグナル）が、しばしば腫瘍細胞で異常に活性化されるという事実から明らかである。

大腸癌におけるWntシグナルの側面を網羅した優れたレビューがすでにいくつかあるため、このレビューの主な焦点は、胚発生や正常または腫瘍性乳房・卵巣における幹細胞の制御における異なる表面受容体を介したWnt5aシグナルの役割にある … Wnt5aによって活性化され、正常組織の機能を温存しながら腫瘍内のCSC（または腫瘍開始細胞）を枯渇させることを目的とした薬剤の合理的設計の難問となっているシグナル伝達経路に関する最新の進歩をまとめた。 Wnt5aシグナル伝達経路

Wnt5a は非正規 Wnt リガンドで、進化的に保存されており、発生において重要な役割を担っている。 ホモ接合型Wnt5aノックアウトマウスは、発生異常による周産期致死である． これまでの研究から、Wnt5aはFzd2および受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体2（ROR2）と相互作用し、βカテニン非依存的にRac1を活性化することが分かっている。 さらに最近、Wnt5a が receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1/2 (ROR1/ROR2) の heterooligermization を誘導し、これが guanine exchange factors (GEF) をリクルートして活性化し、RhoA と Rac1 をそれぞれ活性化して白血球の走化性と増殖性を促進することが明らかにされた . 一方、Wnt5aのもう一つの作用として、Fzd2への結合をWnt3aと競合することにより、in vitroおよび無傷の細胞におけるWnt3a依存性のLRP6のリン酸化とβカテニンの蓄積を阻害し、Wnt3aによるβカテニンの蓄積誘導能を抑制し、βカテニン依存性のWntシグナルを阻害することがわかった .

しかし、Wnt5aもまた、Fzd5受容体を共発現したXenopus胚において、β-カテニン依存性経路を活性化し、二次軸形成を誘導することができた ……。 その後、別の研究により、Wnt5aはROR2を発現する細胞ではcanonical Wnt/β-cateninシグナルを阻害し、Fzd4とLRP5を発現する細胞ではcanonical Wnt/β-cateninシグナルを誘導することが明らかになった . このように、単一のWnt5aリガンドが、受容体の有無によって、細胞に対して異なる影響を及ぼす可能性がある。 したがって、細胞内環境がWnt5aの作用を決定している。 このことは、Wnt5aが異なる癌において発癌性または腫瘍抑制性の効果を発揮するという観測を説明するものかもしれない。

3. 発生幹細胞におけるWnt5aシグナル

Wnt経路（Wnt3a、Wnt5a、またはWnt6によって引き起こされる）は、マウスおよびヒトES細胞の多能性の短期的維持にも関与している可能性があります . このことを示す最初の証拠は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3（GSK3）の薬理学的阻害剤がGSK3活性を調節し、β-カテニン正規化シグナルの活性化とc-Mycの安定性増大をもたらすという研究によってもたらされた … その後、Wnt5aおよびWnt6が胚性線維芽細胞のフィーダー細胞から産生され、血清依存的にマウスES細胞の分化を阻害することが明らかにされた。 Wnt/β-cateninの上流成分を乱すことなく、構成的に活性なβ-catenin（S33Y）を用いてβ-cateninを直接活性化すると、WntのES細胞への作用が完全に再現されることが示された。 重要なことは、Wnt5aはまた、β-cateninのリン酸化を強力に阻害し、それによってβ-cateninを安定化させることである . これらのデータは、Wnt5aがβ-cateninを安定化させ、マウスES細胞におけるWnt/β-cateninシグナルをさらに活性化するシグナルであることを示唆している。 最後に、Wnt/β-catenin経路は、ES細胞の自己再生制御因子として知られるSTAT3のmRNAをアップレギュレートすることから、Wnt/β-catenin経路がSTAT3のレベルでLIF/JAK-STAT経路に収束し、ES細胞の分化を阻止する分子メカニズムがあることが示唆された 。 しかし、ES細胞におけるWnt5a/β-cateninシグナルの活性化にどのような表面受容体が関与しているか、また、非正規WntシグナルもWnt5aによって活性化され得るかについては、依然として不明である

4.ES細胞におけるWnt5a/β-cateninシグナルの活性化 Wnt5aシグナルは正常乳腺と卵巣組織の幹細胞に作用する

一連の証拠は、乳腺の幹細胞の維持におけるWntの重要性を支持している。 しかし、Wnt5aは乳腺組織においてβ-catenin/TCF transactivation活性を誘導することはない。 Wnt5aノックアウトマウスでは、乳腺の細胞は過増殖しているが、異所性のWnt5aの存在下では、管腔の拡張が抑制される 。 これらの表現型は、正規のWnt/β-カテニンシグナル伝達が活性化されるのとは逆である。 したがって、Wnt5aはWnt/β-cateninシグナルを抑制することによって、乳腺の成長を制限し、制御している可能性がある。

ショウジョウバエの生殖器では、卵巣生殖幹細胞（GSC）においてWingless（Wg：ハエのWntホモログ）シグナルが変化し、その制御因子であるdishevelled、armadillo、Axin、shaggyなどの除去が起こる；これによりGSCの損失、卵胞細胞の増殖に影響を与え、分化が誘導される … 卵巣顆粒膜細胞（GC）においてWnt5aの条件付きジーンターゲティングを行うと、卵胞閉鎖の増加や排卵率の低下に伴う女性不妊症が引き起こされることが分かっている。 さらに、Wnt5aは、Wnt/Ca2+経路や平面細胞極性経路を介したシグナル伝達によってではなく、むしろ正則経路を阻害することによって、卵巣顆粒膜細胞（GC）においてグリコーゲン合成酵素キナーゼ3依存経路を介してβカテニンおよびcAMP応答性要素結合（CREB）タンパク質レベルの両方を低下させ、その標的遺伝子を制御することを明らかにした。 これらのデータは、Wnt5aが正常な卵巣卵胞の発達に必要であり、正規のWnt/β-cateninシグナルを抑制することによって、顆粒膜細胞におけるゴナドトロピン反応性に拮抗できることを示している .

総括すると、Wnt5aは胚性幹細胞においてβ-cateninシグナルの活性化が可能だが、乳腺や卵巣組織の正常幹細胞において最も抑制しやすいと言える。 この違いが、胚性幹細胞と正常な乳腺や卵巣の幹細胞で発現が異なる受容体によるものかどうかは、さらに検討する必要がある

5. 乳がん幹細胞におけるWnt5aシグナル

Wnt因子は様々な乳腺上皮細胞に影響を与え、腫瘍の進行中に幹細胞の拡大を誘導する可能性がある。 さらに、異常なβ-カテニンの発現は、基底層、トリプルネガティブ乳がんおよび臨床転帰不良と関連していた。 特定の乳癌のサブタイプにおける異常なWntシグナルの発生は、体細胞突然変異による活性化によって規定される可能性は低い。 β-カテニンをコードするCTNNB1には変異が確認されておらず、APC内の変異は乳癌患者サンプルの20％未満に確認されている。

最近、MMTV-Wnt1マウス初代細胞を用いた研究で、組み換えWnt3aと組み換えWnt5aの両方がin vitroでマンモスフェアの形成を促進することが分かった。 Wnt5aによるマンモスフェアの形成は、正規のWnt/β-cateninシグナルの増加によるものではなく、マウス乳癌細胞において受容体チロシンキナーゼROR2とJun N-terminal kinase、JNKの活性を必要とする非正規Wntシグナルによって媒介されていた . このことは、ROR2を発現している乳癌患者は、ROR2を発現していない腫瘍を持つ患者よりも全生存期間が有意に短いという観察とも一致する . しかし、ヒト乳癌細胞株でROR2をサイレンシングすると、β-カテニン依存性およびβ-カテニン非依存性の標的が減少したことから、ROR2はβ-カテニン依存性およびβ-カテニン非依存性のWntシグナル伝達経路の両方に関与している可能性があることが示唆された。 ROR1 は、再発・転移の可能性が高く、上皮間葉転換（EMT）に関連するマーカーも発現している低分化型腫瘍で主に発現しているようである。 逆に、ヒト乳癌細胞株で ROR1 をサイレンシングすると、EMT に関連する遺伝子の発現が低下し、in vitro での移動・浸潤能や vivo での転移能が損なわれる可能性がある。 ごく最近、Chien らは、ROR1 の発現がトリプルネガティブ乳癌患者における独立した予後不良因子である可能性を報告した . ROR1がROR2と同様に乳癌幹細胞に作用するのか、またROR1が乳癌幹細胞でどのようなシグナル伝達経路を活性化するのかについてはまだ不明である。

ErbB2誘発乳癌のマウスモデルに関する研究では、ヒト乳癌幹細胞に対するWnt5aの作用に関して矛盾する証拠が見つかっている。 ErbB2誘導乳腺腫瘍形成の間，対応する内腔系前駆細胞と比較して腫瘍形成能が増強された基底腫瘍開始細胞（TIC）は，転写物プロファイリング解析により，優先的にWnt5aの発現が消失していた。 さらに、Wnt5aのヘテロ接合体は、腫瘍の多発性と肺転移を促進した。 TGFβ基質として、管腔細胞が産生したWnt5aは、RYKおよびTGFβR1依存的にSMAD2を活性化し、パラクライン様式で基底TICの拡大を制限するフィードフォワードループを誘導し、乳腺腫瘍形成に対するWnt5aの抑制効果の説明となることが期待される。 このマウスモデルでは、正準Wnt/β-カテニンシグナルが活性化されたのか、あるいはWnt5aが正準β-カテニンシグナルを阻害して基底TICの拡大を抑制したのかは、まだ不明であった。 さらに、非正規のWntリガンドであるWnt5aとWnt16だけが、非幹細胞に比べて幹細胞で発現が増加していることが判明した。 したがって、Wnt5aやWnt16は、ヒト乳癌幹細胞において、受容体の状況に依存して、正規または非正規のWntシグナル伝達経路を活性化する可能性がある。 卵巣癌幹細胞におけるWnt5aシグナル

乳癌と同様に、卵巣癌に対するWnt5a効果もまた議論の余地がある。 原発性卵巣腫瘍を対象とした初期の研究では、正常卵巣に比べ卵巣癌のWnt5aが低レベルであることが予後不良であることが示されている（）。 Wnt5aの異所性発現は、in vitroおよびin vivoの同所性卵巣癌マウスモデルの両方で、ヒト卵巣癌細胞株OVCAR5の増殖を阻害する。 メカニズム的には、OVCAR5におけるWnt5aの異所性発現は、正規のWnt/β-cateninシグナルに拮抗し、ヒストンリプレッサーA（HIRA）/前骨髄球性白血病（PML）老化経路を活性化することにより細胞老化を誘導する .

一方、多数の患者を含む研究では、Wnt5aのアップレギュレーションは比較的悪い予後と関連していた .

一方、多くの患者が関与する研究では、Wnt5aと予後に関連があることがわかった。 卵巣癌におけるWnt1の発現頻度と比較して、Wnt5aは悪性上皮性卵巣癌患者においてより頻繁に検出された（全38例中80％）。 注目すべきは、Wnt1とWnt5aの両方を高発現している卵巣がん患者は、Wnt1もWnt5aも発現していない卵巣がん患者に比べて、長期生存の確率が有意に低いということである。 さらに、Wnt5aは卵巣癌患者の腹水中に多く存在し、卵巣癌の微小環境に寄与していることが示唆された。 これは、Wnt5aの高レベルが転移のリスク上昇と関連するという観察と一致している。

卵巣癌では、子宮内膜症性卵巣癌を除いて、正準Wnt経路の活性化変異はまれである。 卵巣癌の進行に対するcanonical Wntシグナル伝達の寄与は未だ不明である。 逆に、非正規Wnt/β-cateninシグナルに関する研究では、Wnt5aは非正規シグナル経路を介して卵巣癌のEMT、移動、転移を制御している可能性が示されています 。 この考えと一致して、最近の研究では、Wnt5aの受容体であるROR1の発現が高グレードの低分化卵巣癌で高発現し、ROR1を発現しない卵巣癌と比較して、無病生存期間および全生存期間が比較的短いことが明らかにされている . ROR1を高発現している卵巣がんは、卵巣CSCと関連する遺伝子発現シグネチャーを有していた 。 さらに、腫瘍細胞における ROR1 の発現は、ALDH1 の発現やin vitroでの腫瘍スフェロイド形成能（いずれも CSC のマーカー）と相関していることが明らかとなっている。 ROR1を高発現している卵巣原発患者由来異種移植（PDX）腫瘍細胞を抗ROR1 mAb（UC-961またはcirmtuzumab）で処理すると、in vitroでのスフェロイド形成と移動、免疫不全マウスでの生着と再移植が抑制されたことから、ROR1が卵巣癌幹細胞の自己再生に影響を与えていると思われる。 ROR1が卵巣がん幹細胞の生物学に与えるらしい影響にWnt5aが関与しているかどうか、さらなる研究が必要である。 結語＜5934＞＜8253＞Wnt5aは胚性幹細胞および器官の発生に重要な役割を果たすと考えられる。 しかし、癌幹細胞におけるWnt5aの役割は多様で複雑である。 腫瘍の進行を抑制することも促進することもある。 細胞挙動を変化させる分子メカニズムを解明するためには、特定の受容体とコアセプターの組織特異的な発現に関するさらなる研究が必要である。 特に、Wnt5aと、胚性幹細胞で発現し、正常体組織では発現しないが癌幹細胞では再発現あるいは再活性化する可能性のある特定の受容体（例：Wnt5a）との間の複雑なクロストークをより詳細に理解することが必要である。 このような研究により、異常なシグナル伝達をブロックする特異的な阻害剤を開発し、患者の生存に好影響を与えることができるかもしれません。

謝辞

本研究は、乳がん研究財団（NIHグラントP01-CA081534）、カリフォルニア再生医療研究所、中国国家自然科学基金（NSFC、グラント番号2016YFC009159）、中国深セン科学技術基金（深セン孔雀イノベーションチームプロジェクト、グラント番号KQTD20140630100658078）により支援されています。