要旨

Wntシグナル経路は多くの必須細胞プロセスに関連している． 本研究では，Wntシグナルが培養HEK293T細胞の増殖に及ぼす影響について検討することを目的とした。 細胞をWnt3aとインキュベートし，Wnt経路の活性化をβ-cateninタンパク質のレベル，標的遺伝子であるMYCとCCND1の発現レベルの分析によって追跡調査した。 β-cateninタンパク質のレベルは最大で4倍まで増加した。 c-Mycとcyclin D1のmRNAレベルはわずかに増加したが、タンパク質レベルは最大1.5倍まで増加した。 Wnt3aで刺激したHEK293T細胞の増殖率を測定したところ、MTTアッセイとBrdUアッセイで異なる結果が得られたのは驚くべきことである。 BrdUアッセイでは、増殖率の増加が検出され、これは適用したWnt3a濃度と相関していた。 一方、MTTアッセイでは、この相関は見られなかった。 ミトコンドリア活性に基づくMTTの結果は、コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体の免疫蛍光法およびウェスタンブロッティングによる分析で確認された。 以上のことから、我々の研究は、Wnt3aがHEK293細胞の増殖を活性化することを示した。 これらの効果は、ミトコンドリア活性の変化を測定するのではなく、DNA合成を測定することによって検出することができる。

1. はじめに

Wntシグナル経路は、細胞の分化、増殖、生存、アポトーシスを制御する重要な役割を担っていることが知られています。 Wntタンパク質は、細胞外マトリックスにあるGタンパク質共役型受容体のFrizzled（Fz）ファミリーの一員と結合することにより、細胞内のシグナル伝達カスケードを活性化する分泌脂質修飾システインリッチ糖タンパク質で、高度に保存されたファミリーである 。 脊椎動物の Wnts は 19 種類あり、細胞質 β-catenin を安定化する能力により、正 規経路と非正規経路の 2 種類に分類される。 最近の研究では、Wnt5aのような特定のWntリガンドは、1つ以上のWntシグナル伝達経路を活性化できることが示されており、厳密に2つに分類することは、ますます時代遅れになってきている。 Wntシグナル伝達経路の機能不全は、骨粗鬆症、クローン病、アルツハイマー病、統合失調症、そして特に癌などのいくつかの疾患に関連している。

リガンドWnt3aはβ-カテニン依存（正準）Wntシグナル伝達に属し、frizzled膜貫通型受容体に結合する。 その後、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5（LRP5）またはLRP6受容体複合体が、細胞質内のディズプレイタンパク質を活性化し、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β（GSK-3β）の阻害を誘発する。 カテニンは、APC（adenomatosis polyposis coli）、AXIN、GSK-3βによって形成される破壊複合体の解体の結果として、細胞質に蓄積される。 その結果、β-カテニンは核内に移動し、T細胞特異的転写因子（TCF）/リンパ球増加因子（LEF）を介した標的遺伝子の転写を活性化することができる。 これらの遺伝子は、細胞増殖、分化、形態形成、細胞接着など、胚および成体の発生における重要な生理学的プロセスを制御する役割を担っている。 Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路は、細胞周期エフェクターおよび成長調節因子を制御するGSK-3βを阻害することによって、G1期の進行を刺激することに重要である。

Wnt/β-カテニンシルグ伝達経路の直接的標的遺伝子としては、結腸癌細胞においてWnt標的として特定されたプロトン遺伝子MYCがある 。 転写制御因子c-Mycは、多くの細胞機能、特に細胞周期の進行を制御している 。 サイクリン D1 コード遺伝子 CCND1 も Wnt/β-catenin 経路の標的遺伝子であり、大腸がん細胞で報告されている 。 サイクリンD1はサイクリン依存性キナーゼ（cdk）4またはcdk6の活性化因子として、G1/S相転移を促進する。 1つの非放射性方法は、5-ブロモ-2′-デオキシウリジン（BrdU）のDNAへの組み込みに基づく免疫アッセイで、DNA合成を測定し、S期移行、したがって細胞増殖に相関する。 もう一つの方法は、生細胞のミトコンドリア活性を測定する方法である。 MTTアッセイでは、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼがMTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) を還元して不溶性の青いホルマザン産物が生成する。

本研究では、Wnt3aリガンド影響下で、MTTと同様にBrdUアッセイを用いてHEK293T細胞の増殖を検討した。 さらに、これらのアッセイの結果を、電子輸送鎖タンパク質SDHA（succinate dehydrogenase complex subunit A）の免疫染色によって測定したWnt3a処理細胞のミトコンドリア活性と比較しました。 細胞および細胞培養

ヒト胚性腎臓細胞であるHEK293Tは、10％ウシ胎児血清（PAN Biotech, Aidenbach, Germany）、1％非必須アミノ酸および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Sigma Aldrich, St.Louis, USA）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で37℃、5％CO2で培養した。

2.2． Proliferation Assays

MTTおよびBrdUアッセイは、96ウェルプレートで行った。 MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) を5mg/mLでPBSに溶解し、20μLのMTT溶液を各ウェルに加え、37℃、5% CO2で3時間インキュベートした。 その後、MTTを含む培地を流し、200μLのDMSOを加えた。 結晶を溶解するために、細胞を室温で15分間振盪した。 プレートは、ELISAリーダー（Tecan Group Ltd., Männedorf, Switzerland）により590nmで読み取られた。 BrdUアッセイには、市販のキット「Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric」（Roche, Mannheim, Germany）を製造者の説明書に従って使用した。 BrdU標識液を添加した後、細胞を37℃、5％CO2で3時間インキュベートした。 最終洗浄工程の後、100μL/wellの基質溶液を細胞に添加し、室温で15分間インキュベートした後、硫酸を用いて反応を停止させた。 プレートは直ちにELISAリーダーで450nmで読み取った。 すべてのアッセイは3連で行った()。 キャリブレーションのために、細胞は異なる数（0,1×104から3×104）で播種された

2.3. 免疫細胞化学および蛍光顕微鏡検査

HEK293T 細胞を24ウェルプレートに播種し、コンフルエンス30％の時点で0〜200 ng/mL Wnt3aで処理し、24、48、72時間後に4％ホルムアルデヒドで固定した。1 : 200の希釈度でSDHA抗体 (Abcam, Cambridge, UK) を加え、細胞を1時間インキュベートした。 細胞核はDAPIで5分間カウンターステインした。 細胞は、蛍光顕微鏡（Observer.Z1 from Zeiss, Jena, Germany）および付属のソフトウェアAxioVision 4.7.

2.4 を介して分析された。 Protein Gel Electrophoresis and Western Blot

Bradford-Assay を用いて、全細胞溶解液のタンパク質濃度を測定した。 等量のタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル（NuPAGE、4-12％、Life Technologies、Carlsbad、USA）にロードした。 ゲルは150Vで1時間行い、iBlot System (Life Technologies)を介してニトロセルロース膜に転写した。 膜は、SDHA、β-カテニン、c-Myc、サイクリンD1、およびβ-アクチンに対する一次抗体（Cell Signaling, Cambridge, UK）を用いて分析し、3％ミルクを含むTBS-Tweenで1：1000に希釈し、適切な西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体（希釈1：2000）とインキュベーションした。 タンパク質のバンドは、ECL検出を用いて可視化した。 RNA Isolation and RT-PCR

全RNAをNucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Germany) を用いて分離し、1μg RNAをVerso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany) で40μLの容量に逆転写させた。 半定量的逆転写酵素PCRに使用したプライマー（MWG、ミュンヘン、ドイツ）の配列は、GAPDHについて5′-catggtgctgagatttgccaac-3′（順）および5′-tcaaccttgaccttcatcac-3′（逆）である。 MYCについては5′-ccgagcaaggacgcgactc-3′（フォワード）と5′-gcctcagagaagcgggtcct-3′（リバース）、CCND1については5′-gcctgaacctgagcca-3′（フォワード）と5′-gtcacttgatcctgg-3′（リバース）であることがわかった。 PCR増幅は、My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Germany)を用いて、製造者のプロトコルにしたがって実施した。 反応は、94℃で2分間の予備変性、94℃で1分間の変性、55℃（CCND1）、57℃（GAPDH）、または60℃（MYC）で30秒間のアニーリング、72℃で1分間の伸長のサイクルを30回実施した。 最終伸長工程は72℃で10分間継続した。 PCR産物は1,5%アガロースゲルでの電気泳動により分析した。 データ分析

Microsoft Excelソフトウェアを、標準偏差の計算を含むデータ管理のために使用した。ウェスタンブロットおよびアガロースゲルは、ゲル文書化システム Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Germany) によってスキャンされた。 バンドはImageJソフトウェア（Wayne Rasband, NIH, Bethesda, USA）を用いて定量化した

3. 結果

3.1. Wnt3aによるβ-カテニンと代表的なWnt標的遺伝子の誘導の影響

Wnt経路の活性化を証明するために、Wnt3aで処理したHEK293T細胞におけるβ-カテニンタンパク濃度量を検出した(図1)。 処理24時間後、Wnt3aの濃度が高くなるにつれてβ-cateninタンパク質濃度は上昇した。 最も高いβ-cateninタンパク質濃度は、200 ng/mL Wnt3aの濃度を持つ24時間後に確認された。 ここでは、コントロールと比較して4倍の増加が定量的に確認された。 処理後48時間および72時間の時点では、β-カテニン誘導の効果はもはや明確に認識されない。 さらに我々は、Wnt3a処理後のWnt標的遺伝子CCND1とMYCの制御を、半定量RT-PCRとウェスタンブロットの両方で分析した（図2、3）。 未処理細胞では、c-MycとサイクリンD1の基底レベルが検出された。 RT-PCRの結果、10 ng/mL Wnt3aで24時間と48時間、100-200 ng/mL Wnt3aで72時間後に、MYC cDNAの量にわずかな変化とCCND1の誘導がみられた。 c-Mycのタンパク質レベルは、24時間後に50 ng/mLの濃度でわずかに増加したことが観察された。 サイクリンD1のウエスタンブロットによる定量では、24時間後のWnt3a濃度が50〜200 ng/mLで1,5倍に増加した。 c-Mycのタンパク質レベルは、24時間後に50 ng/mL Wnt3aの濃度で同様に上昇した。

図2

RT-PCR の結果。 指数関数的に成長するHEK293T細胞を0〜200ng/mLのWnt3aで24、48、または72時間処理した。これらの時点の後に総RNAを単離し、CCND1、MYC、および負荷コントロールとして、GAPDH特異プライマーを用いて半定量RT-PCRを実施した。 定量化のために、発現はGAPDH発現のレベルに対して正規化され、未処理対照は100％とされた。

図3

0-200 ng/mL Wnt3aで24、48または72時間処理したHEK293T細胞のウェスタンブロット解析。膜はサイクリンD1およびc-Myc特異抗体とインキュベートされた。 β-actin抗体はローディングコントロールとして使用した。 定量化のために、タンパク質レベルはβ-actinのレベルに正規化され、未処理対照は100％とされた＜669＞＜669＞＜4419＞3.2。 細胞増殖アッセイ

細胞増殖に対するWntタンパク質の効果を研究するために、HEK293T細胞を96ウェルプレートで24時間培養してから、それぞれ0、10、50、100、150、または200ng/mLのWnt3aタンパク質濃度で処理した。 24時間、48時間、72時間の培養後、MTTおよびBrdUアッセイを実施した。 BrdUアッセイは、明確な傾向を示す；Wnt3aの濃度が増加すると、関連する読み出しが増加し（図4（a））、Wnt3aは、48時間および200ng／mLの濃度後に最高の成長速度を示す。

(a)

(b)

(a)
(b)

図4

増殖アッセイの結果を示す。 HEK293T細胞は、異なる濃度のWnt3aで処理した。 アッセイの値は、24時間、48時間、および72時間後に測定された。棒は、100％に正規化された未処理対照（縦軸）との比較でパーセントとして表されたウェルあたりの細胞数を示している。 すべてのアッセイは3連で行われた。 (a) BrdUアッセイ。 (b) MTTアッセイ。

BrdUアッセイとは対照的に、MTTアッセイはWnt濃度と細胞数との間の相関関係を示さなかった。 細胞数は、それらの関連するコントロールと比較して、すべてほぼ同じままか減少した（図4（b）を参照）

3.3. ミトコンドリア活性

HEK293T細胞におけるミトコンドリア活性に関連するWnt3aの役割をさらに立証するために、SDHAタンパク質の量をウェスタンブロットおよび免疫細胞化学分析によって測定した。 SDHAをサブユニットとするコハク酸デヒドロゲナーゼ（SDH）は、ミトコンドリア電子輸送鎖の複合体IIに関与し、コハク酸からユビキノンへの電子伝達を担うクエン酸サイクルの主要構成要素である。 細胞は、増殖解析実験と同様に処理し、上記のようにSDHA抗体とインキュベートした。 その結果（図5）、Wnt3a処理24時間後に蛍光シグナルが増加し、またウエスタンブロットでもコントロールに対してより強いシグナルを示した。 48時間後、免疫蛍光顕微鏡法またはウェスタンブロット分析によって登録されたタンパク質レベルは、有意な変化を示さなかった。 Wnt3a処理72時間後では、両方の実験においてシグナルの減少さえ観察された。 最も高いシグナルは、50 ng/mL Wnt3aで24時間後に測定された。

(a)

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(c)

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