WWOX は16番染色体の長腕、周知のfragile siteに位置しています。 正規の転写産物（ENST00000566780.5、NM_016373.3）は、前立腺、生殖腺、乳房、肺、内分泌組織、脳で高度に発現する414アミノ酸（aa）のユビキタス蛋白質をコードしている21,22。 WWOXは、前駆体メッセンジャーRNA（プレmRNA）の処理過程で、癌でのみ観察される8つの転写産物を生成します。異常なWWOX mRNAがすべてタンパク質に翻訳されるかは不明です23。 WWOXは、アミノ末端に2つのWWドメイン、核局在シグナル（NLS）モチーフ、C末端に短鎖デヒドロゲナーゼ還元酵素（SDR）ドメインを持つ（図1b）。 ミトコンドリア標的配列（MTS）モチーフも、SDRドメインの209番と273番の間にマッピングされている（参考文献24）。 WWOXはまた、補酵素、NAD（H）またはNADP（h）結合部位（GANSGIG、aa 131-137）および潜在的基質結合部位（YNRSK、aa 293-297）を含む（ref. 1）。 WWOXのC末端ドメイン（aa 125-414）はMAPT相互作用領域（http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZC7）と類似している。

WWOX 関連疾患（SCAR12, WOREE症候群およびDSD）に見られる、WWOX遺伝子変異体。 DSD disorder of sex development, IF in frame, OOF out of frame, WOREE WWOX-related epileptic encephalopathies. MTS mitochondrial targeting sequence, NLS nuclear localization signal, SRD short-chain dehydrogenase reductase.

WOX はミスセンス拘束指標 Z = -3.19 (Exome Aggregation Consortium) と、ミスセンス変異に寛容。20 この遺伝子の全てまたは一部に影響を与えるヘテロ接合型 CNV は健康対照試料で多く観察されている (Database of Genomic Variants)．WWOX関連脳症が常染色体劣性遺伝であることを考えると、公開データベースで病原性／推定病原性変異が多いことは驚くべきことではない。 動物モデルでは、WWOXの欠損によるてんかんや運動失調が認められ、3,27神経変性過程が示唆されている。 Aldaz と共同研究者は、文献の詳細なレビューで、WWOX が癌、メタボリックシンドローム、脳症の交差点にあることを明確に示した28

SCAR12 または WOREE の表現型を持つ文献のすべての患者の臨床および分子データは、補足の表 3 に記載した（文献 3,4,5,6,7,8,29,30 のいずれか）。 また、WWOXホモ接合型変異（c.1228G>T; p.Gly410Cys）を有するアラブの血族家系の姉妹の患者2名も2016年にAlkhateebらによって報告されているが（文献9）、これらの症例で同定された変異の病原性には疑問がある。 いずれも発語の遅れを呈し、1例は2歳からてんかんを有していた。 この家族の臨床症状は、WWOXのバイレリック生殖細胞変異体を持つ患者に観察されるWOREE症候群と比較して、非常に軽度である。 この410位のグリシンからシステインへの変化は、タンパク質のカルボキシル末端側の最末端のアミノ酸に影響を与える。 さらにこのアミノ酸変化は、gnomADデータセット中の2人の個体でホモ接合型に存在している。 in silicoの予測では、このミスセンス病原性変異体の病原性（おそらくPolyPhen-2によるダメージ）を支持しているが、この家族ではその原因的な役割は疑問視されている。

我々は、健康な両親から受け継いだWWOXの2回性病原性変異を持つ20人の追加患者からなるWOREE表現型を持つ最大のコホートについて報告する（補足表1）。 分子診断は、異なる手法（アレイCGH、qPCR/MLPA、ターゲットサンガーシークエンス、ESおよびWGS）の組み合わせによって行われた。 これまでに文献で報告されているすべての症例と私たちの患者を合わせると、27家族37人のWOREE症候群とWWOX病原性バリアントの二重鎖が知られている。 合計29の異なる病原性／可能性の高い対立遺伝子（10個のCNVと19個のSNV）が同定されています（図1a、b）。 WWOX遺伝子のイントロン5と8は、それぞれ220 Kbと780 Kbの大きさで、非常に大きな遺伝子である。 これらはWWOXゲノム配列の90％を占め、多発性骨髄腫の転座切断点を含んでいる28。これは、大きなイントロン領域はしばしば組み換えを起こしやすく、染色体切断点を生じやすいという事実と一致している。 したがって、エクソン6から8を包含する重複（1アレル）および欠失（5アレル）は、WWOX関連疾患の患者で観察される最も頻度の高い病原性CNVである（補足表1および3）。 血縁関係にある家族からの患者（10/27；37％）はすべて、有病率の低い常染色体劣性障害によく見られる、同一の劇症型対立遺伝子をホモ接合体で有していることがわかった。 1つまたは2つの病原性CNVからなる遺伝子型を持つ家族の割合が高いこと（14/27；52％）は、重度の中枢神経系疾患を持つ患者におけるWWOX遺伝子座のスクリーニングに定量的アプローチが必要であることを強調している。 複数のエクソンに影響を及ぼすCNVをヘテロ接合で持つ患者では、（1）2つの小さなCNVの複合ヘテロ接合の可能性と、両方の両親におけるMLPAまたはqPCRによる2度目の定量分析の必要性、（2）標的サンガー配列決定による第2のアリル上のSNVを検索することが重要である。 同様に、ESや標的遺伝子パネルシーケンスを第一選択として行う場合、欠失や重複が起こりやすいこの大きな遺伝子では、そのコード配列のすべてまたは一部に関わるCNVの検索が不可欠である。

この研究では、8つの新しいミスセンス病原性変異を報告した（補足表2）。 エクソームと標的遺伝子パネルのハイスループットシーケンスの結果では、WWOXミスセンスバリアントは多数存在する。 WWOXは多くの機能とタンパク質パートナーを持つため，その病原性の確立は困難である。 我々は、American College of Medical Genetics and Genomics（ACMG）のガイドライン31に従って、WWOXデータのミスセンスバリアントの解釈とアノテーションを行い、病原性、病原性の可能性、意義不明バリアント（VUS）、良性の可能性、良性に分類した。 バリアント解釈のプロセスを支援するために、ACMGガイドラインで概説されたエビデンスカテゴリーに基づいてバリアントを効率的に分類する、オープンに利用できるオンラインツール（http://www.medschool.umaryland.edu/Genetic_Variant_Interpretation_Tool1.html/）を使用した31。機能喪失が疾患のメカニズムとして知られている遺伝子において、4つのaa変化（p., p., p.）とnullバリアントのトランスに関連があることが判明した。 WWOX関連脳症の個体で同定されたすべてのミスセンス変種（12家族で11のaa変化、補足表2）は、ウェブベースのソフトウエアの組み合わせによって疾患原因となることが予測される。 さらに重要なことは、gnomADではどれもホモ接合状態で存在しないことである20。すべてのミスセンス変種は、ACMGの勧告に従って、病原性または病原性の可能性が高いと分類されている。 一人の患者（P19）は、3つの異なるミスセンス病原性バリアント：p.;（補足表1）のキャリアである。 p.(Lys200Glu) と p.(Thr358Ile) はシスに位置している。358位のスレオニンは既知の機能ドメインに位置していないが、両方のアミノ酸変化は病原性の可能性が高いと予測される。 これらの変異の一方または両方が、P19の疾患の原因となるミスセンス変異であるかどうかは判断できない。 ここで報告され、医学文献に発表されたほとんどの症例では、WWOXの配列変異は基本的なDNAレベルで記述されている。 1つ（P3；p.）を除くすべてのミスセンス病原性変異は、実験的証拠（RNAまたはタンパク質配列が解析されていない）のないin silico研究に基づいて解釈されている。 P3では、逆転写PCR（RT-PCR）産物のサンガー配列決定によるトータルRNA解析で、白血球におけるスプライシング異常を検出できなかった。 他の患者については、分子診断時に適切な血液サンプルが得られなかったため、RNA調査は行わなかった。 エキソニックSNVは、生理学的なアクセプター/ドナーのスプライスサイトだけでなく、エキソニックスプライシングエンハンサー（ESE）およびエキソニックスプライシングサイレンサー（ESS）にも影響を及ぼす可能性がある。 33 既知の疾患関連ミスセンスバリアントの10%までが、一般的なSNPsのわずか3%がプレmRNAスプライシングを変化させています。 これは病原性機能喪失アリルを持つ遺伝子では、なおさらあり得ることである。 SRDドメインのミスセンス変異体については、基質が同定されていないため、WWOXの触媒活性への影響を評価することが困難である。

本研究に含まれていないある患者では，トランスの2つのSNVからなる二重鎖遺伝子型（ナンセンス（ENST00000566780.5：p.Gln72*）とミスセンス変異（ENST00000402655：c.600T>A, p.Ser200Arg)。 200位のaaの変化は311残基の非RefSeq WWOXタンパク質にのみ影響する。 これまでのところ、すべての病原性のあるaa変化は、9-exonの転写物（ENST00000566780.5、アイソフォーム1）の翻訳から生じる正規のWWOXタンパク質（414 aa）に従って記述されてきた。 311残基からなるWWOXタンパク質のアイソフォームがWWOX関連疾患に関連しているかどうかは不明である。 さらに、この患者の表現型はWOREE症候群と比較して軽度であった。

WWOX, cancer, and lung disease?

WWOX はWWドメインと様々な発癌性タンパク質とのタンパク質間相互作用を介して癌関連経路の調節に関与する癌抑制遺伝子である． WWOXタンパク質の欠損は複数の新生物に見られる23。Wwox-/-マウスでは骨肉腫や肺がんが観察され22、腫瘍形成はWwox hypomorphic遺伝子型の結果の一つである34。WWOXの機能的コピー喪失CNV（67048）は中国人集団においてがんリスクの増加と有意に関連していた35、36、37。 最近、マウスの肺でWWOXの発現が失われると好中球性の炎症が起こることが示されました38。驚くべきことに、WWOX生殖細胞変異のバイラインを持つ患者やそのヘテロ接合体の親では、癌患者の増加が報告されたことはありません。 最初の数年間に高い頻度で早死するWOREE症候群の重症度は、癌がないことを説明することができる。 しかし，WWOX ヌル対立遺伝子をヘテロ接合で持つ患者に対しては，納得のいく説明ではない． Wwoxのアブレーションは、すべてのノックアウト動物モデルにおいて腫瘍化しない。この推定腫瘍抑制遺伝子は、発癌中のイニシエーションよりもむしろ腫瘍の進行に関連する可能性が高い。

WWOXとDSD

WWOX は下垂体、精巣、卵巣などのホルモン制御組織で高発現し、ゴナドトロピンや性ステロイド生合成に役割を果たすと推定される1、39。 WWOXのSRD酵素ドメインは、まだ同定されていない基質を用いたステロイド代謝に関与していると考えられている。 これらの観察と、生殖腺に異常がある2種類のWWOXノックアウトマウスの記述34,39は、明らかに生殖腺の発達におけるWWOXの役割を支持している。

ヒトで最初のWWOXの生殖腺再配列は46、XY DSDと関連していた2。 彼は、遅発性初潮の病歴を持つ母親から受け継いだエクソン6から8の欠失のヘテロ接合体であった。 このCNVはインフレーム欠失を引き起こし、SRDドメインの大部分が欠落した短い産物をもたらすと予想される。 最近、DSDの患者において、WWOX遺伝子の3つのヘテロ接合型VUSがESにより同定された（図1）（文献40）。 我々の知る限り、WOREE症候群の患者のヘテロ接合性の両親におけるDSDは報告されておらず、DSDの分子的病因におけるヘテロ接合性SNVs/CNVsの関与は疑問であると考える。 精巣の萎縮、生殖能力の低下、生殖腺の異常、ライディッヒ細胞の機能不全、乳腺の発達障害は、WWOX切除のいくつかの動物モデルで観察される表現型の一部である。28 我々の知る限り、DSDはヘテロ接合体のノックアウト動物モデルでは報告されていない。

SCAR12 phenotype

2014年，常染色体劣性脊髄小脳失調症（SCAR12）の2血族6名の患者において，WWOXのホモ接合性ミスセンス病変がESにより確認された． これまでのところ、この関連性は他の家系では確認されていない。 3 WOREE症候群と比較すると、SCAR12は発達の遅れが少なく、全員が歩けるようになり（4/4、100%）、4人中3人が話すことができ、早死は報告されていません。 脳MRIでは、軽度の小脳低形成（2/2、100%）を示し、この特徴は我々のコホートでは観察されなかった。 SCAR12では、てんかんは常に認められるが、抗てんかん薬に反応することが多かった（2/4；50％）。 また、眼球の関与も認められ、4名に眼振が報告されている。 このようなWWOX関連常染色体劣性遺伝性小脳失調症は、稀な遺伝性疾患であると思われる。 WOREEの表現型が重篤であること、患者の一部が早死にすることから、小脳機能障害に関連したバランス障害が隠されている可能性がある。

WOREE phenotype

SCAR12表現型の記述のすぐ後に、WWOXは9家族17人の劣性型乳児てんかん性脳症に関与していることが示された4，5，6，7，8，9，30。 我々の患者さんの表現型は、これまでの報告と一致しています。 本研究で報告された複合ヘテロ接合型遺伝子の割合が高いことに伴い、我々のコホートでは血縁関係の割合が低いことが観察された。 これらの遺伝子型は、array-CGHやハイスループットシーケンスを単独で行った場合、以前は見逃されていたかもしれない。 エクソーム配列データからのCNV予測の実施により、SNVとCNVの両方からなるWWOX遺伝子型を持つ患者の同定が容易になる。

2015年に脳の異常と子宮内発作の可能性を持つ胎児1人が報告された（参考文献7）。 以前の報告（4/17）では妊娠中の兆候として核透光性の増加が最も頻度が高かったのに対し，我々のシリーズでは胎動低下が時折報告された（3/20）。 手足の拘縮は，出生前または新生児期に，我々のコホートでは5例，文献4，5，6では3例で報告されている．

文献とは異なり、成長障害（6％）および小頭症（20％）は、平均身長（-1.1 SD）および平均OFC（-1.4 SD）が正常であった我々の患者では、目立った特徴ではなかった。 半数以上の症例で異形性が報告された。 最も顕著な特徴は、頬が膨らんだ丸顔、短い首、低身長顔貌であった（Fig. 2）。 P15 と P16 では，低身長症は残っているが，顔面がより三角形になる。 その他の医学的問題としては，診断の手がかりとなるような早期発症の側彎症または後彎症（65％），他の乳児脳症にみられるように，70％に栄養管を必要とする摂食障害，40％に呼吸障害がみられた

全例に重度の発達遅延を認めた． 座位，会話，歩行は皆無であった。 神経学的検査では，ほとんどの患者で軸索の低緊張と遠位の高緊張がみられた。 時折，ジストニー運動がみられた。 文献にあるように、全例が早期発症のてんかんであり（100％）、毎日発作が起こり、ほとんどの症例で薬剤耐性が観察された（95％）。 熱性けいれんに対する大きな感受性は認められなかった。 痙攣と脳波の不整脈を特徴とするWest症候群が26%にみられた。 焦点性発作，全身性発作，複合発作がみられた． 強直発作、間代発作、強直間代発作、ミオクロニー発作のほか、小児けいれんや欠神も記述された。 このように、てんかんは非常に重篤で、早期に発症し、発作の主症状もさまざまであった。 先に述べたように、視覚障害はWOREE症候群の臨床スペクトルの一部であると思われる。 ほとんどの症例が無眼球であった（75％）。 また，約半数の症例で眼底像の変化（47％），視神経萎縮や網膜ジストロフィーを示唆する電気生理学的検査（45％）を認めた． したがって，早期発症のてんかん発作と発達遅滞の患者においては，早期の眼科検査が診断の手がかりとなる可能性がある． 脳MRI（図3）では，80％の症例で脳梁低形成（75％），脳萎縮（55％）を中心に異常が認められた． 早死はWOREE症候群の特徴であり、8例（40％）、平均死亡年齢40カ月であった。

WWOX関連てんかん性脳症（WOREE）症候群患者の脳磁気共鳴画像（MRI）． a-j 矢状面で脳梁の低形成，k-q 軸位面（P4，P6，P14）および冠状面（P3，P7，P17）で脳萎縮とクモ膜下腔の拡大が認められる。 r-t 軸位T2上の対称性白質低信号。 u-v 軸位T2上の斜頭症および非対称性側脳室。 w P19 T1矢状面の脳梁内側の円形病変(低信号)。 このレビューから、WOREEは、自発運動能力の低下、言語発達と歩行習得の欠如、早期発症の薬剤耐性発作、眼科的病変、および早死の可能性の高さを特徴とする非常に重症なてんかん性脳症であると結論づけることができる。

Phenotype/genotype correlations

WWOX関連神経発達障害について、最近、WWOX遺伝子型を3群に分類し、表現型と遺伝子型の相関が示唆された5,7。 この分類によると、2つのヌルアレルを持つ患者は最も重症のWOREE表現型を示す可能性が高く、一方、2つのミスセンス変異を持つ低型遺伝子型は、代わりに脊髄小脳失調症（SCAR12）を引き起こすとされた。

最も重篤な臨床症状は、WWOXの完全ノックダウンに相当する早発停止コドンからなる遺伝子型と関連しているようであった。 これらの遺伝子型は7例に認められ、P10におけるexon 1から4のホモ接合体欠失、p.(Arg54*)とp.(Trp44*)のホモ接合体停止コドン、4、30最初の6つのexonのホモ接合体欠失が挙げられる7。 さらに、早死はミスセンスの病原性バリアントのみの遺伝子型を持つ患者には報告されていない（補足表1、3）。

結論として、WWOXの生殖細胞変異はWOREE症候群と呼ばれる重症早期発症てんかん性脳症と明らかに関連しており、我々はこの神経疾患を持つ最大のコホートについて報告する。 DSDやSCAにおける体質的なWWOX変異の意義については，まだ再現研究が必要である

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