Modification of Winkler’s method for determination of dissolved oxygen concentration in small sample volumes
DOI: 10.1039/C0AY00110D(Technical Note)アナログ.Note。 Methods, 2010, 2, 1618-1622
First published on 27th August 2010
Winkler法は、水試料中の溶存酸素（DO）濃度を測定する最も一般的な方法である。 しかし、この方法では、DOを正確に測定するために200mLという比較的大きな試料量が必要です。 しかし，この方法では，正確なDO濃度を測定するために200mLという大量の試料を必要とする。このため，少量の試料でDO濃度を測定する代替法が数多く提案されているが，ほとんどの方法は，精度が低い，コストが高い，装置が複雑，分析時間が長い，という問題を抱えている。 本論文では，体積1mL の試料中のDO 濃度を測定するために，Winkler 法に簡単な改良を加えた方法を提案する。 提案した方法は，正確で，低コスト，簡便かつ迅速である。 33 試料のDO 濃度を従来のWinkler 法（WM）および提案法（PM）の両方で測定した． 分析した33サンプルのうち23サンプルについては，測定値の母平均が等しいという仮説（μ1 = μ2）を95%信頼区間で棄却することができず，19サンプルについては，測定値の母分散が等しいという仮説（σ21 = σ22）を95%信頼区間で棄却することができなかった。 8467>
はじめに
ウィンクラー法(Method No. 4500-O-C)1 は、様々な水試料中の溶存酸素濃度測定において、正確で信頼できる方法2として普遍的に受け入れられています。 この方法は、DO測定のベンチマークと考えられています。 しかし、この方法の主な欠点は、200 mLという大量の試料が必要なことです3
DOの測定には、数多くの代替法も開発されています。 これらの方法は、（1）比色法、（2）ガスクロマトグラフィーによる方法、（3）電気化学および光学センサーによる方法の3つに大別される。 このうち比色法は，少量の試料でDOを測定することが可能である。 しかし，高価な試薬（例：ゴールドゾル）や有毒な試薬（例：シアン化合物）が必要である4 ことや，測定波長の選定に適切な根拠がないことも問題である5． しかし，ガスクロマトグラフィーは，正確で少量の試料で測定できる反面，時間と費用がかかる． また，電気化学センサは，不可逆的な圧力効果，硫化水素による汚染，交差感度などの問題がある7）． 近年では，動的酸素発光消光の原理を用いた光センサーが注目されている8 。 しかし、電気化学式、光学式にかかわらず、すべてのセンサーは、温度や圧力に敏感であるため、ウィンクラーの方法に対する校正が必要である。9,10 また、センサー表面でのバイオファウリングや細菌の繁殖にも敏感である。8
上記のような代替法の固有の限界と、クロスチェックや校正のためにウィンクラー法に依存することから、ウィンクラー法自体へのいくつかの修正も1-10 mLのサンプル量でのDO濃度測定のために提案されている。11,12,13 しかし、そのような「マイクロウィンクラー」法は複雑な装置要件と大気酸素との交換によるサンプルの汚染を避けるための入念な注意事項からあまり一般的ではない。 これらの方法については，他の文献で批判的なレビューがなされている14 。最近，微量試料のDO測定法として，重量法マイクロウイン クラー滴定法15 が提案された。 しかし、この方法は高感度天秤を用いた複数回の正確な重量測定が必要であり、そのため非常に複雑であると思われる。
文献調査によると、小試料のDO測定用に開発された方法のほとんどすべてが、何らかの形で欠陥があるようである。
提案手法の概要
微量サンプルのDO濃度測定における最大の課題は、大気との相互作用によるサンプルの汚染を防止することである。 そこで、水試料と大気との間に絶縁性の液体層を設けることを提案した。 絶縁性液体には、水が混ざらないこと、水より密度が小さいこと、酸素溶解能が無視できることなどが要求される。 この絶縁性液体をバイアルに取り、DOを測定したい水試料（1mL量）を絶縁性液体層の下に直接導入することが提案されている。 これにより，水試料は実質的に大気から遮断される。 その後、ウィンクラー法と同じ試薬で試料中のDOを固定し、等量のヨウ素に変換することができる。 このヨウ素溶液を注射器でバイアルから取り出し、Na2S2O3を用いて滴定し、試料中のDO濃度を決定する。
数回の試作の後、上記のように絶縁液体としてn-ヘキサンを選択した。n-ヘキサンは水より軽く（比重0.7）、水とほとんど混ざらない。 n-ヘキサンの酸素溶解度は0.002モル分率16、すなわち酸素は実質的にn-ヘキサンには溶解しない。
材料と方法
使用した試薬はすべて分析試薬グレード(>99%純度、Loba Chemicals, India)であった。 試薬の調製と試料の希釈には、脱イオン水(Milli-Q, Millipore, USA)を使用した。 使用したn-hexaneはHPLCグレード(>99% purity, Merck, India)であった。 ホウケイ酸ガラス器具は本研究で使用した。 MnSO4およびアルカリ・アジド・ヨード溶液は標準法(Method No. 4500-O C)に従って調製した1
提案法(PM)によるDO測定手順は以下の通りであった。 まず、0.5 mLのn-ヘキサンを16 mLのガラスバイアル(Wheaton Science, USA)に移し替えた。 次に，2 mLピペットにn-hexaneを1 mL採取し，さらにDO濃度を測定したい水試料を1 mL注入した． 以上の手順により，ヘッドスペースのない試料を採取することができた。 ヘキサン-水界面やピペット内に気泡や空隙があると誤差が生じるため，このサンプル採取は最も重要なステップである。 その後、ピペットの口をバイアル内のヘキサン層の下に置き、ヘキサン層の下に試料を導入し、試料と大気が接触するのを避けた。 ピペットでの試料採取とバイアル内のヘキサン層下への試料投入は、誤差を少なくするためにできるだけ早く行う必要がある。 次に、10μLマイクロシリンジ（米国ハミルトン社製）を用いてヘキサン層下の水試料に5μL MnSO4を導入し、続いて5μLアルカリアジド-ヨウ化物溶液を同様に追加した。 沈殿物の形成は添加直後から始まり、3分以内に完了した。 その後，ヘキサン層下に形成された沈殿に，マイクロピペットを用いて濃H2SO4 0.1 mLを添加した。 沈殿物は3分以内に溶解し，ヘキサン層の下に黄色のヨウ素溶液が形成された。 このヨウ素溶液をマイクロシリンジでヘキサン層の下からちょうど1mL取り出し、25mLビーカーに移した。 ビーカー内の1mLヨウ素溶液は、滴定を容易にするため、脱イオン水を加えて約10mLに希釈した。 脱イオン水の添加はヨウ素溶液を希釈するだけで、ビーカー内のヨウ素量には影響しない。 ビーカーの中身は0.00625 M Na2S2O3溶液で滴定しました。 この滴定液1mLは、元の試料中のDOの55.5 mg L-1に相当する。 滴定液は250μLマイクロシリンジ（Hamilton, USA）に取り、ヨウ素の黄色がほぼ排出されるまで絶えず攪拌しながらビーカーに滴下して加えた。 その後、デンプン溶液を1〜2滴加え、デンプンによる青色が排出されるまで滴定を継続した。 また、ウィンクラー法(WM)を用いて各種試料中のDO濃度を測定した結果、ある滴定に要した滴定液の量から、元の試料中のDO濃度を算出しました。
| Sample No.1。 | 試薬 | 量 | 強度 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| WM | PM | ||||
| 200 mL | 1 mL | – | |||
| – | 1 mL | 5 μL | WM | ||
| アルカリ性アジド・ヨード試薬 | 1 mL | 5 μL | As per WM | ||
| Na2S2O3 | As required | As required | 0.00625M | ||
| 1 mL | 0.00625M | WM | |||
| WM | |||||
| 未使用 | 1.5 mL | – | |||
Results and discussion
インド、カンプール市周辺から得た33の水試料（表2参照）でDO濃度を測定しました。 33試料のうち、水道水8試料、河川水16試料、水道水で希釈した生活排水6試料、地下水2試料、池の水1試料である。 これらの試料は，多様な試料マトリックスでDO濃度を測定できるように選択された。 各試料について，WMとPMの両方で数回のDO測定が繰り返された． WMとPMがそれぞれ算出した平均値（
），標準偏差（S1，S2），再現測定回数（n1，n2）を各試料について表2に示す。
両手法による測定値の正規プロットはすべてほぼ直線であり、測定値が正規分布していることを示し、これを基にさらなる統計解析が可能であることを示しました。 図1Aは、WMで測定した5つのサンプルの正規分布図である。 8467>
WMとPMによるそれぞれのサンプルの複製測定における分散（S21，S22）は、F検定を用いて対応する母分散（σ21，σ22）の一対比較に使用された。 2つの方法（WMとPM）でDOを測定した33サンプルのうち、19サンプルについては、母分散が等しいという仮説（σ21 = σ22）を95％の信頼水準で棄却することができなかった。 さらに、σ21 > σ22という仮説は4標本で棄却できず、σ21 < σ22という仮説は残りの10標本で、すべて95%信頼水準で棄却できなかった。 これらの結果は表3にまとめられている。
さらにWMとPMで得られた各標本の分散 (S21,S22) とサンプル平均 (
) を用いて対応する母平均 (μ1, μ2) の一対比較も行いました。 分散が等しいサンプル（表3参照）については、スチューデントのt-検定を用いて一対比較を行った。 WMとPMの両方でDOを測定した33試料中23試料では、母平均が等しい（μ1 = μ2）という仮説は、95％の信頼水準で棄却されなかった。 図中のエラーバーは95％信頼区間に対応する。 また、同図には原点を通る単位勾配の直線も描かれている。 これは，表3に示した一般的な結論と一致している。つまり，ほとんどの試料で，2つの方法によって得られた平均DO濃度は統計的に異なっていない。 このように、ほとんどの場合、PMによるDO測定はWMによるDO測定と同等の精度を有していた。 エラーバーは95%信頼区間を表す。
WMとPMでそれぞれ得られた各試料の標準偏差（S1、S2）を互いにプロットしたのがFig.3である。 同図には原点を通る単位勾配の直線も描かれている。 この場合、点は単位勾配の線に対してかなり均一に分散しているように見え、ある点は線に近く、他の点は離れていることがわかる。 これらの結果は、表3から得られた結論とも概ね一致している。すなわち、ほとんどの試料において、2つの方法で測定されたDO濃度のばらつきは、統計的に差がないことがわかる。 このように，ほとんどの場合，PM による DO 測定は WM による DO 測定と同程度の精度であった．
サンプルの取り扱いと滴定を慎重に行えば、提案法（PM）は精度・正確さの両面でWinkler法（WM）と同等の結果を得られると結論づけられた。 しかし、PM法によるDOの定量精度は、最終滴定に用いるマイクロシリンジの最小カウントを低くすることで向上すると考えられる。 本研究で使用したマイクロシリンジの最小カウントは5μLであり，本研究の条件下では，約0.25mg L-1 DOの不確かさに相当する．
結論
この研究の目的は、少量の試料でDOを正確に、低コストで、簡単かつ迅速に測定する方法を開発することであった。 提示された結果と分析に基づき、提案された方法は上記の問題のほとんどを解決していると結論づけることができる。 本研究の主な結論は以下の通りである。
➢ n-ヘキサンの絶縁層を導入し、水系試料と大気との間の酸素移行を防止することで、少量の試料で安定かつ正確にDOを測定できる。
➢提案した方法は、十分な注意を払うことで、DO濃度の平均値および平均値に関するDO濃度の分散に関して、Winklerの方法(WM)で得られた結果と統計的に比較できる結果を得られることも実証されました。
➢ 試薬やガラス器具の必要量はWinkler法より少なく、その主な理由は使用する試料量が少ないためです。追加試薬としてn-ヘキサンを使用しますが、少量（1試料あたり約1.5 mL）であり、試料分析全体のコストにほとんど影響を与えません。 特に、試料量に制限があり、ウィンクラー法が使用できない場合に有効である。