Global bla KPC-E. coli株は、最も一般的なSTであるST131内でも多様であり、地域的な伝播の証拠がある

45 株が4大陸11か国21都市から得られた（2010～2013年、過去の実験室でのタイピング結果は表S1にまとめてある）。 1株は全ゲノムシークエンス（WGS）においてBla KPC陰性であったが、これは最初の型別が行われた時点から、その後のWGSのためのDNA抽出と準備までの間の保管またはサブカルチャーにおいてBla KPCが失われた可能性がある。 1つの分離株では、WGSデータが実験室でのタイピング結果と一致せず（ecol_451）、実験室の取り違えと思われたため、ecol_252とecol_451はその後の分析から除外された。 その他の43株は配列決定に成功した（品質指標は表S1参照）。 これら43株のうち、21種類の大腸菌のSTが確認された（表1；WGSからin silicoで予測）。 ST131 , ST410 , ST38 , ST10, ST69 (残りの分離株はシングルトンST).

すべてのKPC-大腸菌分離株で同定された注釈付きオープンリーディングフレーム（ORF）16,053個のうち、すべての分離株（「コア」）で共通していたのは2,950個（18.4%）、さらに95-< 100%の分離株（「ソフトコア」27）では222個（1.4%）のみである。 ヌクレオチドレベルでは、コアゲノムに213,352個の一塩基変異（SNV）があり、以前に観察された種の多様性と一致した28。 耐性遺伝子プロファイルも株によって大きく異なり、複数のβ-ラクタム、アミノグリコシド、テトラサイクリン、フルオロキノロン耐性機構を保有するもの（例：ecol_224）、Bla KPCのみを保有するもの（例：ecol_584；図1）などがあった。 KPC-ST131 16株については、4,071/7,910 (51%) のORFがコアゲノムであり、これらの分離株のコアゲノム全体で6,778個のSNVが存在し、これもST131多様性に関するこれまでの世界的研究23、24と一致した（図 S1）。 アクセサリゲノムは、コアゲノムで近縁だった一部の株 (例: ecol_356/ecol_276/ecol_875) では非常に一致したが、すべての株 (例: ecol_AZ159/ecol_244) では一致しておらず、コアゲノムとアクセサリゲノム間で進化のダイナミクスが大きく異なることが裏付けられた（図1）。 また、コアゲノムとアクセサリゲノムの両方で近縁な分離株の地理的分布は、特定のKPC-E. coli株の局所的な伝播（例：ecol_AZ166、ecol_AZ167）を支持するものであった。 これらの近縁の分離株ペアのBla KPC遺伝子周辺の遺伝子フランキングモチーフの相同性もこの仮説と一致し、特にデータセットの残りの部分（下記参照）で観察されたBla KPCフランキング配列の多様性を考えると、同じ遺伝子背景での複数のBla KPC獲得事象との一致度は低いだろう。

2008-2013 年のグローバル カルバペネム耐性監視スキームから特定された KPC-Escherichia coli の系統樹。 系統図の右側のパネルは、共通の耐性遺伝子機構（耐性遺伝子タイピングの全詳細は表S2に記載）、コアゲノムおよびアクセサリーゲノムの構成要素を表している。

bla KPC遺伝子は現在大腸菌のプラスミドコンテキストに限定されているようだが、単一のプラスミド構造上の複数コピー、または高コピー数のプラスミドに存在する可能性がある

34株（80％）のBla KPC-2と9株（20%）のBla KPC-3の分離が確認された。 bla KPCの染色体統合は，他の腸内細菌科，シュードモナス，アシネトバクター属で報告されているが，まだまれである5, 29, 30. ロングリードシーケンスから再構築された18の染色体構造、あるいは他の25株のbla KPC含有コンティグ（イルミナのde novoアセンブリから得られた）の注釈のいずれにも、bla KPCの染色体統合の証拠はなかった。 bla KPCアレルはSTによって分離されなかった。

細菌染色体あたりのbla KPCコピー数の推定値は<1 (ecol_879, ecol_881) から55 (ecol_AZ152) の間で変動した。 9つのケースでは、この推定値は細菌染色体あたりのbla KPCの10コピー以上であった（ecol_276, ecol_356, ecol_867, ecol_869, ecol_870, ecol_875, ecol_AZ150, ecol_AZ152, ecol_AZ159, Table S2）。 これらのうち6株はcol様のプラスミドコンテキストにBla KPCを含んでいたが、2例ではプラスミドrepのタイプが不明であり、1例ではIncNレプリコンであった。 プラスミドコピー数は、関連する遺伝子が高コピーユニット上に位置する場合、より高いレベルの抗生物質耐性と関連する。 興味深いことに、高コピー数のプラスミドは、分割システムを必要とせず、偶然により十分に分布するため、子孫の細胞に固定される可能性が高く31、あらゆる抱合イベントにおいて、直接的または間接的に移行すると推測されている32,33,34。

bla KPCおよびnon-bla KPCプラスミド集団は、世界のKPC-大腸菌において極めて多様である

Plasmid Inc typingにより、分離株あたり4種類のプラスミドレプリコン（中央値：1-6、IQR：3-5）が存在し、広い多様性を表している（Table 1）。 しかし、IncN、col、IncFIA、IncI1レプリカは、特定のSTに偏って多く存在していた（p < 0.05; 表1）。 PacBioによる配列決定を受けた18の分離株のうち、1,459 bpから289,903 bpまでの53の閉じた非ブラKPCプラスミドを同定した（表S1；少なくとも4つの追加の部分完全プラスミド構造が存在する）。 これらの非ブラKPCプラスミドのうち、10個（サイズ：2,571〜150,994 bp）はGenBankで利用可能な他の配列と<70%の類似性（配列一致率に相同性を示すクエリー長の割合をかけたもの）を有しており、KPC-大腸菌の「プラスミドーム」の一部が不完全なまま特徴づけられていることが強調された。 他の43のプラスミドについては、GenBankのトップマッチは、大腸菌が35例、K. pneumoniaeが5例、Citrobacter freundii, Shigella sonnei, Salmonella Entericaがそれぞれ1例であった(Table S3)。

22のbla KPCプラスミド構造が完全に分解され（Pacbioデータのみから17、Illuminaデータのみから4、PacBioとIlluminaデータの両方から1）、14,029 bpから287,067 bp（中央値= 55,590 bp、IQR： 23,499-82,765 bp）までの範囲が確認されました。 これらのBla KPC含有プラスミドと、レプリコンを含むコンティグ上でBla KPCが同定された追加6例は、Inc型別に基づいて非常に多様であった(表S1)。 IncNが最も一般的なタイプで（n = 8/28 型付け可能なbla KPC構造；29%）、次いで小型のcol様プラスミド（n = 6/28；21%） であった。 その他はあまり一般的でないタイプであった。 A/C2，FII（k），U（いずれもn＝2），L/M，P，Q1，R（いずれもn＝1）であった． 4つ（14%）のBla KPCプラスミドがマルチレプリコン構築物であった：col/repA、FIB/FII、FIA/FII、およびFIA/FII/R

Common IncNプラスミドバックボーンは、E.M.の世界的に分散している。 大腸菌

GenBank から、KPC 産生大腸菌の最も早い報告の頃である 2005 年から、ユニークで完全に配列決定された IncN-bla KPC プラスミド配列 (表 S4) をすべて選んで比較しました。 これらの16のプラスミドリファレンスと12の研究配列のサブセット（「方法」参照）におけるBla KPCを取り巻くプラスミドバックボーンと周辺配列は、分岐した大腸菌STにおける2つの既知のIncN-Tn4401-Bla KPC複合体の多重獲得と一致した：第1に、プラスミド-9（FJ223607、2005、米国）様のバックグラウンド内、第2に、プラスミド-12（FJ223605、2005、米国）様のバックグラウンド内のTn2/3様要素内であった。

第一に、Plasmid-9、pKPC-FCF/3SP、pKPC-FCF13/05、pCF8698、pKP1433（ハイブリッドIncNを表す）、および分離株ecol_516、ecol_517、ecol_656、ecol_736（本研究）からのBla KPCプラスミド間の遺伝子類似性が同定された。 プラスミド-9は、Tn4401bの重複要素を逆向きに含み、4種類の5bpフランキング配列がグループIIイントロン内に非典型的な配置で存在する35。 このグループの他のプラスミドのバックボーン構造は、プラスミド9の構造の祖先バージョン内のpld領域とtraG領域の間でTn4401bエレメントが別々に獲得され、フランキングTTCAG標的部位重複（TSD）が発生したことと一致する（プラスミド9様プラスミド（仮説）と表示、図2）。 国際的な広がりとそれに続く種内・種を越えた局所的な進化が、以下のようなプラスミド間の違いを説明することになる。 (i)ヌクレオチドレベルの変異（すべてのプラスミドで観察される）、(ii)小さな挿入／欠失事象（すべてのプラスミドで観察される）、(iii)トランスポゾンを介した大きな挿入／欠失事象（例えば、pCF8698_KPC_2）、および（iv）おそらく相同的組み換え、結果として類似プラスミドバックボーンの中でのクラスターの変異（例えば、…）。 ecol_656/ecol_736）、および「ハイブリッド」プラスミド（例：pKP1433）の形成を含むより明確な再配列をもたらす相同組換えと思われる（図2）。

FJ223607類似（プラスミド9類似）IncNプラスミド（公知；本研究）とその分離地理起源／日付の比較模式図である。 赤字のプラスミド配列名は、PacBioデータから得られた本研究のものと、イルミナデータから得られた閉じた（ecol_517, ecol_656）または不完全なプラスミド構造（ecol_516, ecol_736）である。 プラスミド名に隣接する整列バーはプラスミド配列を表す。薄いグレーは配列同一性が100%の領域を、黒は配列間の塩基多様性を、細線はインデルを表す。 コーディング配列は、個々の配列バーの下に太い矢印で表し、カラーキーに従って色分けしている。 配列間の遺伝的変異を説明する挿入図は、同定された進化的事象の例を示している。 (a)一塩基レベルの変化、(b)小インデル(≤100 bp)、(c)大インデル(>100 bp)、(d)組換え事象。

プラスミド12（FJ223605）において、Tn4401bはTn2-Tn3様ハイブリッド要素（bla TEM-1, bla OXA-9, いくつかのアミノグリコシド耐性遺伝子などの関連薬剤耐性遺伝子と）に挿入されている。 しかし、標的配列の重複がないことから、おそらく分子内の複製転位現象によって標的部位配列のミスマッチが生じたものと考えられる（L TSS = TATTA; R TSS = GTTCT）。 この複合体は、8bpの逆方向反復配列に挟まれた2つのIS15DIV（IS15Δ）/IS26様要素の間に位置し、traI（3末端から891bp）とpld遺伝子座（〜28Kb；図3A）の間に位置する。 IncNプラスミド12のバックボーン成分は、NIHのアウトブレイク5やバージニア大学のアウトブレイク（CAV1043; 2008）6で見られたリアレンジバージョンと一致している。 本研究では、ecol_224, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_422のプラスミド、ecol_AZ151, ecol_744, ecol_AZ150の足場はすべてプラスミド12とほぼ同じ構造を持ち、トラジ・トライ遺伝子にクラスター状の塩基レベル変異が生じており、この領域に影響を及ぼす相同組み換え事象と散発的挿入／欠失事象が確認された（Fig.3A）。 しかし、これらの分離株におけるBla KPC-Tn4401構造は、Tn2/Tn3様要素、ISKpn8/27、Tn1721などの他の移動性遺伝要素（MGE）の存在によってほとんど分解される。 ecol_224では、Bla KPC-2は、TTGCT TSDに挟まれた2つの繰り返し逆Tn3様構造の一部として、プラスミド-12の前述のIS15DIV（IS15Δ）/IS26様複合体よりもtraIに近い（3´端から136 bp）位置に、IncNバックボーンに挿入されている（Fig. 3B）。 このゲノム領域の進化の歴史を正確にたどることはできないが、ecol_422, ecol_744, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_AZ150 および ecol_AZ151 にこの構造の共有サインが存在することは、bla KPC-2 を挟む多数の MGE の存在を介した共通の獲得、およびその後の複数の転位があることを示唆するものであった。

本研究によるFJ223605様（プラスミド12様）IncN KPCプラスミドの比較模式図である。 パネル3A。 プラスミド/コンティグ構造の地理的起源、分離日、および全体的なアライメント。 赤色のプラスミド配列名は、PacBioデータから得られた本研究のものであり、イルミナデータから得られた閉じた（ecol_224, ecol_422, ecol_881, ecol_AZ159） または不完全なプラスミド構造（ecol_744, ecol_AZ151, ecol_AZ150） である。 プラスミド名に隣接する整列バーはプラスミド配列を表す。薄いグレーは配列相同性100%の領域、黒は配列間の塩基多様性、細線はインデルを表す。 コーディング配列は、個々の配列バーの下に太い矢印で表され、カラーキーに従って色分けされている。 配列間の遺伝的変異を説明する挿入図は、同定された進化的事象の例を示している。 (a)一塩基レベルの変化、(b)小さなインデル（≦100bp）、(c)大きなインデル（>100bp）、(d)組換えイベント。 パネル3B. 研究分離株のみにおけるBla KPC-2を含むtraIとpldの間の領域のクローズアップ。 コーディング配列は図3Aと同様に色分けされている；本文中で言及された配列領域は注釈されている。

Col様プラスミドは、E. KPCにおけるbla KPCの重要な感染ベクトルを表す可能性がある。 大腸菌

Small col-like plasmid は、大腸菌において bla KPC を保有するプラスミドとして 2 番目に多いタイプでした (n = 5 )が、そのうちの 3 種類は同一 (bla KPC-2, 16,559 bp) で、すべて米国ピッツバーグで 2 年間に ST131 から分離されました (ecol_276 , ecol_356 , ecol_875 ). これらの3つの分離株は、さらにFIA、FIB、FII、X3およびX4レプリコンを含んでおり、SNV/コアおよびアクセサリーゲノム解析の両方と一致して、長期間にわたってクローン株+プラスミドが安定して持続していることを示唆している (Fig. 1, Figure S1)． Tn4401に隣接する5bpの配列は、両方のケースで直接的な分子間転座と一致した（ecol_870: TGTTT-TGTTT; ecol_867: TGTGA-TGTGA）． col/repA共統合プラスミドもこのデータセットで観察された（ecol_AZ161）。このプラスミドではTn4401bがcolE3署名配列とTn3エレメントの間に挿入されていた（Tn4401 TSS：AGATA-GTTCT）． このようなコ・インテグレート・プラスミド構造の形成は、E. col/pKpQIL に似たプラスミド構造 (pKpQIL は歴史的に bla KPC と関連している) を含む36。

Col に似たプラスミドは、他の小規模、地域的研究において KPC プロデューサーと関連していた21、38。 懸念されるのは、これらの小さなベクターが、明らかな抗菌薬選択圧がない場合でも、フルオロキノロン耐性を媒介する qnr 遺伝子の種間拡散に関与することが示されていることである39。 本研究では、col様プラスミドが特定の大腸菌ST（主にST131）と有意に関連していることが、この系統におけるBla KPCの不釣り合いな発現の一つの説明となる可能性がある。

Diverse Tn4401 5 bp target site sequences (TSSs) support high transposon mobility

Bla KPC-2 または bla KPC-3 を挟む完全なTn4401アイソフォームは、Tn4401a/a-like (n = 10.) を含む24/43 (56%) 個々の分離株にのみ観察されました。 bla KPCの上流でコンティグが切断されたもの）、Tn4401b（n＝12）、Tn4401d（n＝2）変異体を含む24/43株（56％）のみに認められた。 11種類の5bp標的部位配列（TSS）対が同定されたが、そのうち7種類（64％）はGenBankからダウンロードしたどの比較プラスミドにも観察されなかった（表S5）。 Tn4401aは3つ、Tn4401bは7つ、Tn4401dは1つの異なる5bpのTSSを有していた。

GenBankプラスミドの全セットと他の研究者によって行われたin vitroトランスポジション実験から、30種類の5bp TSSペアが特徴づけられており、そのうち7つは実験環境のみでのものであった40。 ダウンロードしたプラスミドは、様々な種と時点（2005年～2014年）から採取されているが、サンプリングバイアスの結果として、より広いTn4401挿入サイトの多様性を十分に表していない可能性がある。 しかし、我々のデータは、多様なTn4401アイソフォームの獲得に伴う大腸菌内での著しいTn4401の移動性と、他の種から大腸菌への複数の輸入事象を表していることと一致するだろう。

Bla KPCとTn4401の伝統的な関連性は、大腸菌のKPCプラスミドにおいて著しく損なわれている

特に、他の19/43 (44%) 分離株では、Tn4401構造がMGEで置換されて分解され、その一部のみが以前に記述されていた41, 42。 2つの分離株は新規のTn4401Δb構造(IS26またはIS26-ΔIS5075による上流切断)を有していた。 Tn4401eに似た構造（Bla KPCの上流255bp欠失）が3つの分離株（ecol_227, ecol_316, ecol_583）に見られた。これはさらにPacBioプラスミド完全集合（ecol_316）において特徴づけられており、ISKpn7要素のL TSS部位における再配列を表していた。 このプラスミドでは、2番目の部分的なTn4401要素がBla KPCなしで存在し、これは不完全な複製的分子内転位現象と一致する（GGGAA＝2つのTn4401b要素のL TSSとR TSS、逆向き）。 bla KPCの近傍にある他のモチーフは以下の通り。 ハイブリッドTn2/Tn3要素-ISKpn8/27-bla KPC (n = 1; ecol_224); IS26-ΔtnpR(Tn3)-ISKpn8/27- bla KPC-ΔTn1721-IS26 (n = 5; ecol_AZ153-AZ155, ecol_AZ166, ecol_AZ167)． ISApu2-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC- korC-klcA-ΔTn1721-IS26 (n = 1; ecol_542); IS26-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC-korC-IS26 (n = 1.0); IS26-tnpR(Tn2)-ΔblaTEM -bla KPC- korC-IS26 (n = 1.0); ecol_545）；ハイブリッドTn2／Tn3要素＋ΔblaTEM-bla KPC-ΔTn1721（n = 2; ecol_744, ecol_422）、Tn3要素-Δbla TEM-bla KPC- ΔTn1721（n = 4; ecol_881, ecol_AZ151, ecol_AZ159, ecol_AZ150）、ΔTn3-Δ -ΔIS3000（Tn3-like）（n = 1; ecol_AZ152）であった。 このようにBla KPC遺伝子の周辺に存在する独立したMGEの多様性は、Bla KPCが動員される手段を拡大するものである。 興味深いことに、以前に観察されたように43、このデータセットのすべての分解されたTn4401配列は、隣接するTn2/3様配列の可変長と関連しており、Tn4401がTn2/Tn3様コンテキストに挿入されたことにより、後者が他のMGEの挿入のホットスポットとして機能することができたかもしれないことを示唆している6。 特に注目すべきはIS26との関連である。IS26はCTX-M ESBLを含む大腸菌の他の耐性遺伝子の拡散に関連しており24, 44、密接に位置する耐性遺伝子の発現を増加させることができ45、共集合体形成に関与し、それゆえプラスミド再編成を行う46、IS26を保有するプラスミドへの他のIS26媒介移動事象を促進する46.

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