本研究ではIRE1a-XBP1経路の役割を理解するために基本戦略は試験管のTh2分化モデル（図）を使用することにある。 1b). ナイーブTヘルパー細胞をTh2分化条件下で抗CD3e/CD28コートプレートで72時間TCR活性化し、42時間休ませた後、抗CD3e/CD28コートプレートを用いてTCR活性化により再刺激を行った。 IRE1a-XBP1経路を阻害するために、IRE1aエンドヌクレアーゼ活性を阻害することで経路を特異的に遮断する、よく知られた薬剤4μ8cを使用した 。 この薬剤は、培養開始時および活性化プレートから静止プレートへの移行時に15-μMの濃度で培養液に添加された。 薬物濃度の選択は、細胞毒性が低く、IRE1a阻害効率が最も高いことで決定した（追加ファイル1：図S1）。 我々は、ナイーブおよび再刺激Th2（薬剤処理および未処理）リンパ球のトランスクリプトームをRNA配列決定により比較し、再活性化Th2におけるXBP1転写因子結合部位をChIPmentation（ChIP-配列決定）により特定し、ゲノム全体のデータを統合して直接標的とその制御役割を予測しました。

Tヘルパー細胞はin vitro活性化時にIRE1a-XBP1経路をスイッチオンする

活性化・分化したTヘルパー細胞は、豊富なサイトカインを分泌している。 そのため、細胞がこの分泌ストレスに適応するためには、よく発達した分泌機構が必須条件となる。 Tヘルパー細胞の活性化におけるER-stress/UPR経路の関与を予測するために、ナイーブなTh2細胞と分化したTh2細胞（restimulated Th2）のトランスクリプトームを比較検討した。 この比較から得られた差次的発現遺伝子をKEGGパスウェイ「Protein Processing in the Endoplasmic Reticulum」に統合し、発現量が増加または減少している構成要素を可視化した。 解析の結果、ナイーブTヘルパー細胞が活性化されTh2細胞に分化すると、ERストレス経路に関与する遺伝子の発現が上昇することがわかった（Additional file 1: Figure S2）。 XBP1自身を含む、タンパク質の折り畳みや分泌の制御因子として以前に特徴づけられたいくつかの因子が、Tヘルパー細胞の分化中に発現上昇する。

この予測を検証し、特にIRE1a-XBP1経路の関与を調べるために、試験管内で分化および再活性化したTh2リンパ球におけるIRE1a mRNAおよびタンパク質発現を測定した（図1b）。 細胞は、mRNAとタンパク質をそれぞれ比較するために、qPCRとウェスタンブロットで解析された。 その結果、活性化したTヘルパー細胞では、mRNAとタンパク質レベルの両方が上昇していることがわかった（図1c、左および中央のパネル）。 IRE1aのリン酸化は、その機能状態を示すことが知られている。 その結果、活性化されたTh2リンパ球において、このタンパク質がリン酸化されることが確認された（図1c、右図）。 このphospho-IRE1aの増加は、タンパク質の合成が増加したことで説明できるが、キナーゼ活性の増加や自己リン酸化の可能性も排除できない。 ウェスタンブロットバンドのデンシトメトリー解析から、タンパク質合成のアップレギュレーションとリン酸化の増加という両方のメカニズムが関与していることが示唆された。 タンパク質のアップレギュレーションは3倍に増加したが、リン酸化タンパク質は4.5倍に増加した（図1c）。

活性化されたIRE1aはスプライスされていないXBP1（XBP1u）mRNAをスプライスして、スプライスされたXBP1（XBP1s）mRNAアイソフォームを生成している。 Tヘルパー細胞の活性化に伴い、スプライシングされたXBP1（XBP1s）がmRNAおよびタンパク質レベルで増加することが観察された（図1d, e）。 ポジティブコントロールとしてツニカマイシンを使用した。 これは、N-結合型糖鎖を阻害することにより、アンフォールドタンパク質の蓄積（すなわち、小胞体（ER）ストレス）を引き起こし、IRE1a活性を高めることによりXBP1sを増加させる薬剤である。 4μ8cで処理することによりIRE1aエンドヌクレアーゼ活性を特異的に阻害すると、XBP1s mRNAとタンパク質アイソフォームの両方が消失し、スプライシングフォームの形成がIRE1a活性に依存していることが確認できた（図1d、e）＜6827＞＜6892＞これらの結果から、IRE1a-XBP1経路はTh2リンパ球で保存され、in vitro Tヘルパー細胞活性化に伴ってアップレギュレートされていることが確認された。 6827>

In vivo活性化Tヘルパー細胞はIRE1a-XBP1経路をアップレギュレートする

IRE1a-XBP1経路が生体内のCD4+T細胞で機能しているかどうかを調べるために、Th2駆動型免疫反応のよく知られたモデルである蠕虫寄生虫Nippostrongylus brasiliensisをC57BL/6マウスに感染させました …。 感染後7日目に、Tヘルパー細胞におけるXBP1sタンパク質の発現をフローサイトメトリーによって解析した。 その結果、虫に感染したマウスのTヘルパー細胞は、感染していない対照マウスと比較して有意に多くのXBP1sを発現しており、経路のアップレギュレーションが示唆された（図2）

感染時の生体内でTヘルパー細胞がIRE1a-XBP1経路をアップレギュレートした例。 線虫（Nippostrongylus brasiliensis）感染マウス（感染後7日）の脾臓細胞をPE結合抗XBP1s抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した（ゲーティング戦略：singlet > live cells > CD4+CD3e+ > XBP1s+）. 1つの代表的なFACSプロファイルが表示され（左パネル）、すべての結果（n = 4）を含むグラフが「右パネル」に示されている

これらの結果は、経路がin vivoで活性であることを確認するものであった。 そこで、Th2リンパ球において、ゲノムワイドなアプローチを用いて、この経路の解明に着手した。

Genome-wide transcriptomic analysis of differential gene expression reveal IRE1a-XBP1-regulated genes

IRE1a-XBP1経路のグローバルな遺伝子調節役割を捉えるために、細胞培養液中に4μ8cを添加してIRE1a endonuclease活動を阻害した細胞とin vitro活性化Th2細胞とを比較検討した。 次に、活性化したTh2リンパ球のトランスクリプトームを、IRE1a-XBP1経路を阻害したものと阻害していないもので比較した。 4μ8c処理および未処理のTh2細胞のトランスクリプトームは、mRNA配列決定（RNA-seq）により取得した。 RNA配列決定データの品質管理は、Additional file 1に示す。 図S3に示す。 ナイーブおよび活性化Th2リンパ球のトランスクリプトームを比較すると、10995個の遺伝子がTh2活性化時に差次的に制御されていることが分かった。 4μ8c処理によるIRE1a-XBP1経路の阻害は、未処理のTh2コントロールと比較して、3144遺伝子の差次的発現をもたらした（図3a、追加ファイル1：図S3右パネル）。 これらの遺伝子のうち2670個がTh2分化に関与していた（図3a）。 これらの遺伝子を階層的にクラスタリングすると、4μ8c処理によって発現が増加する遺伝子群と減少する遺伝子群が明らかになった（Additional file 1: Figure S3, right）。 これらの遺伝子を詳細に調べたところ、多くの遺伝子がタンパク質変性反応や小胞体ストレスに関連しており、IRE1a-XBP1経路（図3b）がこれらの生命現象に大きな影響を及ぼしていることが明らかとなった。 差次的に発現する遺伝子の完全なリストは、Additional file 2: Table S1に記載されている。 Th2細胞への4μ8c処理により差次的に発現したこれらの遺伝子（すなわち、IRE1a-XBP1経路制御遺伝子）のGene Ontology（GO）解析により、以下の生物学的プロセスにおいて濃縮されていることが示された。 「ERストレスへの応答」（GO:0006950）、「シグナル伝達の制御」（GO:0009966）、「サイトカイン産生」（GO:0001816）、「細胞増殖」（GO:0008283）、「細胞周期」（GO:0007049）および免疫応答（GO:0006955）（図3c）に富むことを示した。 IRE1a阻害によるこれらの遺伝子発現パターンの変化は、XBP1転写因子がTh2の活性化、増殖、分化に広く関与していることを示唆している。 そこで、XBP1転写因子のゲノムワイドなクロマチン占有パターンを見出すことにした。

4μ8cによるIRE1a-XBP1阻害によるTh2における遺伝子発現の違い。 ナイーブTヘルパー細胞を4μ8cの存在下または非存在下のTh2分化条件下で活性化させた。 抗CD3e抗体および抗CD28抗体をコートしたプレートで3日間活性化し、2日間休息させた後、コートしたプレートで6時間再活性化させた。 「Naïve → Th2」は、ナイーブTヘルパーとTh2細胞との間で発現が異なる遺伝子を示す。 「Th2 → Th2+4μ8c “は、未処理と4μ8c処理したTh2の間で発現が異なる遺伝子を示す。 b unfolded protein responseによって生じるERストレスの解消に関与することがよく知られている、発現が異なる遺伝子を示すヒートマップ。 ヒートマップは、赤-青のカラースケールで、赤が発現増加、青が発現減少を示し、行のZスコアで示されるスケール化された発現値を示す。 c Th2と4μ8c処理Th2との間で異なる発現遺伝子のジーンオントロジー（GO）分析

XBP1 ChIPmentation reveal XBP1 direct target genes in Th2 cells

XBP1のゲノム全体のクロマチン占有を特定するために、XBP1, XBP1に対するChIPグレードの抗体を用いて、従来のChIP-seqアプローチよりも高速、高感度、堅牢であることが示されている最近開発された手法であるChIPmentationを実施した。 XBP1 ChIPには、試験管内で分化させたTh2細胞と再活性化させたTh2細胞を使用しました。 2つの独立した生物学的複製が行われました。 各複製でそれぞれ1930万と2240万のペアエンドリードを得た。 MACS2でq値0.01以下、fold enrichment 5以上で解析したところ、2つの複製でそれぞれ9031と7662のピークが確認された。 bedtoolsを用いたオーバーラップ解析では、5892のピークが両レプリカに存在することが示唆された。 予想通り、XBP1の標的遺伝子であるHspa5（ERシャペロンタンパク質BiP、別名Grp78）をコードするプロモーター領域付近に結合ピークが確認され、XBP1自身のプロモーター付近にも結合イベントが確認された（図4a）ことから、XBP1の自己制御の可能性が示唆された。 XBP1の結合部位に関連するゲノム上の特徴を調べるため、HOMERを用いて、そのピーク位置とRefSeq遺伝子を比較したところ、XBP1の結合部位は、RefSeq遺伝子と同じ位置にあった。 XBP1結合ピークの多くは、プロモーター（注釈付き転写開始点から上流1000bp、下流500bpと定義）領域（36%）とイントロン領域（35%）に位置しており、遠位遺伝子間結合事象（25%）も頻繁に観察された（図4b）。 XBP1のピークのゲノム分布は、プロモーターと潜在的なエンハンサーの両方に結合することを示している。

Th2リンパ球におけるXBP1転写因子のゲノム全体のクロマチン占有度． XBP1 ChIPmentationを試験管内分化Th2細胞で行い、ゲノムワイドなXBP1クロマチン占有率を得た。 a UCSCゲノムブラウザから、示された代表遺伝子周辺のXBP1結合ピークのスナップショット。 c JASPARデータベース（上）、ヒト乳がん細胞株のChIP-seq（中）、マウスTh2リンパ球（下）のXBP1モチーフを比較したもの。 e GREAT

で解析したXBP1結合ピークに富む生物学的プロセスのGO用語

XBP1レギュロームの特徴をさらに明らかにするために、HOMERを用いてde novo motif discoveryを行ってXBP1結合領域内に富むDNAモチーフを特定した。 その結果、乳がん細胞株で定義されたヒトXBP1結合モチーフとほぼ同じコンセンサス配列GCCACGTがトップのモチーフとして同定された（図4c）。 このことは、XBP1の結合特異性が、ヒトとマウス、そして細胞種を超えて高度に保存されていることを示している。 マウスのデータで最も濃縮されたモチーフは、JASPARデータベースのXBP1モチーフとも類似しており、このことからも、我々のChIPmentationデータの質の高さが裏付けられます。 2番目に濃縮されたモチーフはNF-Y結合モチーフであった（Additional file 1: Figure S4C）。 興味深いことに、NF-Yモチーフは細胞周期遺伝子、特にG2/M細胞周期制御に関与する遺伝子のプロモーター領域周辺に頻繁に見出されている。 XBP1モチーフとNF-Yモチーフは、258個のXBP1結合ピークの一部で共起しており（図4d）、XBP1とNF-Y転写因子が協力して標的遺伝子のサブセットを制御する可能性があることを示している。 XBP1とNF-Yによって共制御される可能性のある標的遺伝子のリストを追加ファイル3: 表S2に示し、XBP1標的の完全なリストも追加ファイル3: 表S2に示す。 上位5つの濃縮モチーフは、Additional file 1に表示されている。 図S4Cに示す。 XBP1結合遺伝子の機能を調べるために、GREATを使用してXBP1結合ピークの特徴を調べた。 このことは、XBP1の既知の生物学的役割と一致する。

ChIPmentation 実験から、XBP1がタンパク質の折り畳みや分泌の促進、Th2リンパ球の活性化において役割を果たすことが予測される。

トランスクリプトームデータとChIP-seqデータの統合によるXBP1制御遺伝子制御ネットワークの解明

XBP1制御の直接標的遺伝子とその転写制御ネットワークを明らかにするために、ゲノム全体のトランスクリプトームデータとChIPmentationデータの統合を行った。 直接標的遺伝子は、IRE1a阻害（すなわち4μ8c処理）時の発現の差と、遺伝子座でのXBP1転写因子の占有によって定義される。 その結果、Th2において1143個の直接標的遺伝子が見つかり、そのうち122個の標的は他の細胞型（すなわち筋肉、膵臓β細胞、形質細胞）においてXBP1直接標的として既に報告されていた（図5a）。 このことから、1021個の遺伝子がTh2特異的であると考えることができる。 XBP1の直接的な標的に対する作用には方向性がなく、アップレギュレートされる遺伝子とダウンレギュレートされる遺伝子が含まれている。 これらのパターンのいずれかに従う上位38遺伝子を図5bに示し、完全なリストは、追加ファイル4: 表S3に記載されている。 最も重要な生物学的プロセスおよびパスウェイは、タンパク質折り畳みおよびERストレスに関連しており（追加ファイル1：図S5）、これは既知の生物学的役割と一致し、また新規のTh2特異的標的も含んでいる

ChIPmentation と RNA-seq データの統合により、XBP1 直接標的遺伝子とその制御ネットワークが明らかになりました。 a 他の分泌細胞型の既報告の XBP1標的遺伝子と本研究の Th2直接標的遺伝子を比較するベン図です。 本研究のXBP1直接標的遺伝子は、「Th2におけるXBP1占有遺伝子」と「分化型発現遺伝子（Th2→Th2+4μ8c）」の両カテゴリーで共通する遺伝子である。 B細胞/プラズマ細胞、骨格筋細胞、膵臓β細胞のXBP1直接標的遺伝子は、Acosta-Alvearらが観察したもので、ここでは比較のために用いた。 b XBP1直接標的遺伝子の発現パターンを示すヒートマップである。 c 転写制御ネットワーク：XBP1の直接の標的である転写因子。 4μ8c処理により発現量が増加した遺伝子（アップレギュレート：赤、ダウンレギュレート：青）。 差次的に発現していないがXBP1のChIPseqピークを持つ転写因子を右側のリストに示した

この経路の制御にはXBP1の役割が優位であるが、他の転写因子も関与していることが判明している。 XBP1制御に続く制御カスケードを調べるために、プロモーターまたはエクソン／イントロニックChIP-seqピークを持つ注釈付き転写因子を抽出して、転写制御ネットワークを構築した（図5c）。 転写因子の完全なリストは、Additional file 5: Table S4に記載されている。 XBP1によって直接制御される転写因子は、タンパク質分泌ERストレスの解消、細胞周期と増殖の制御、エフェクター免疫細胞の機能制御の3つの機能カテゴリーに大別される。 ERストレスに関与する転写因子は、Th2リンパ球のサイトカイン分泌を促進する可能性が高い。 この予測は、膵臓のアシナー細胞や形質細胞などの分泌細胞におけるこれまでの報告に基づいている。 これらの転写因子、すなわちBhlha15、Atf3、Atf6、Atf6b、Atf4、Creb3l2は、ERの分泌ストレス適応に関与することが示されている。

細胞増殖と細胞周期に関連した転写因子の目的は、活性化したTh2細胞の急激な拡大を制御することであると考えられる。 免疫反応関連因子はTh2細胞の分化やサイトカイン産生に関与している可能性が高い。 そこで、サイトカイン分泌、細胞増殖、サイトカイン産生におけるXBP1sのダウンレギュレーションの影響を検証したいと考えた。

Tヘルパー細胞においてIRE1a-XBP1経路はサイトカイン分泌を制御する

XBP1s-制御遺伝子をゲノム規模で比較し、この因子がサイトカイン分泌に関与していると予想された。 この予測を検証するために、Th2細胞のIRE1aエンドヌクレアーゼ活性をブロックし、細胞培養上清を分析し、ELISA法でIL4レベルを定量した。 IL4は、XBP1のダウンレギュレーションによってmRNAとタンパク質が変化しないため、検証可能な候補サイトカインとして選択した（Additional file 1: 図S6A左パネル、図6左および上段中パネル）。 また、4μ8c処理した細胞では、IL4の分泌が有意に抑制されることを見出した（図6上段右パネル）。 この結果は、予想通り、Th2細胞におけるサイトカイン分泌の促進にIRE1a-XBP1経路が関与していることを裏付けている。 再刺激期における経路の阻害は、IL4分泌に対して有意な阻害効果を示さなかった（Additional file 1: Figure S6B）。 この結果は、XBP1sがTh2分化中に必要であり、おそらく効率的な分泌装置の開発に必要であることを示唆している。

IRE1a-XBP1 pathwayがTh2リンパ球におけるサイトカインの発現および分泌に必要なことを示す図。 ナイーブTヘルパー細胞をTh2活性化条件に従ってIRE1a阻害剤4μ8cの存在下で3日間培養し、2日間休ませた後、コーティングプレートで再活性化し、細胞内サイトカインIL4、IL5、IL13発現をフローサイトメーターで分析した。 代表的なFACSプロファイルは、最初の2列に表示されている。 細胞内サイトカイン発現は、3～7個の独立した生物学的複製で、第3列に比較されている。 第4列：4μ8c処理またはDMSO処理したTh2からの細胞培養上清をELISAで分析し、サイトカイン濃度を測定した。 FACS gating: lymphocytes > singlets > live cells > cytokines

The IRE1a-XBP1 pathway controls IL13 and IL5 cytokine expression

IL5 とIL13 は好酸球、アレルギー、蠕虫感染に関わる2種類の顕著なタイプ2サイトカインである。 IRE1a-XBP1経路を阻害すると、IL5とIL13のタンパク質発現と培養液への分泌が有意に抑制されることを見出した（図6中段右、下段左）。 バイオインフォマティクスによるTh2トランスクリプトーム解析の結果、IRE1a-XBP1経路はIL5とIL13の遺伝子発現を積極的に制御していることが予想された（追加ファイル2：表S1）。 この予測は、RT-qPCRを介した遺伝子発現解析（Additional file 1: Figure S6A, middle and right panel）およびフローサイトメトリー（Fig. 6）により検証された。 これらの結果は、IL5とIL13を調節する経路の転写的関与を示唆している。

IRE1a-XBP1経路は活性化依存性Tヘルパー細胞増殖を促進する

細胞増殖率は正と負のレギュレーターの相互作用の結果である。 我々は、IRE1a-XBP1経路を4μ8cで遮断した場合、細胞増殖遺伝子の正と負の両方の制御因子をコードする遺伝子が異なって発現することを観察した（図7a、左図、追加ファイル7：表S6）、そのうち多くの遺伝子はXBP1の直接標的であることが判明した（図7a、右図、追加ファイル8：表S7）。 このことから、IRE1aの阻害により増殖速度が変化することが予想される。 そこで、IRE1a-XBP1阻害による細胞増殖への影響を確認することに興味を持った。 Th2細胞を用いて、細胞増殖アッセイを行った。 ナイーブ脾臓 CD4+T細胞を CellTrace violet で標識し、4μ8c の存在下または非存在下で Th2 分化条件下で活性化させた。 蛍光色素の減衰は、フローサイトメトリーでモニターした。 我々は、XBP1sのダウンレギュレーションが細胞増殖を有意に阻害するが（図7b）、細胞死を誘導しないことを見出した（追加ファイル1：図S7）

IRE1a-XBP1 経路は活性化依存性のTh2細胞増殖および細胞サイクルを促進する。 a 左パネル：4μ8c処理および未処理Th2トランスクリプトームにおいて異なる発現の細胞増殖関連遺伝子の階層的クラスタリング。 右図：細胞増殖に関与することが知られているXBP1直接標的遺伝子の階層的クラスタリング。 b 脾臓ナイーブTヘルパー細胞をCellTrace Violet色素で染色し、Th2分化条件下で72時間活性化し、フローサイトメトリーで解析したものである。 細胞増殖のヒストグラムにおいて、Th2細胞の世代は「赤」、4μ8c処理細胞は「青」である（左パネル、代表的な1つの実験）。 5つの独立した生物学的複製から得られた分裂指数のグラフ表示（右パネル）

Tヘルパー細胞の増殖は、分化およびサイトカイン産生と関連している。 IL5およびIL13の発現の減少（図6）は、細胞増殖が遅延しているという事実によって潜在的に説明され得る。 しかし、もし増殖の低下が分泌不足の主な理由であれば、IL4産生も抑制されるであろう。 しかし、IRE1a阻害によるIL4発現の有意な変化は観察されなかった（図6、追加ファイル1：図S6A）。 この矛盾をさらに調べるために、IL13-GFPおよびIL4-GFPレポーターマウス株を用いて、細胞増殖アッセイを行った。 IL4-GFP発現Th2細胞では、4μ8c処理により、72時間までの細胞分裂の最初の数世代でIL4産生の阻害が観察された（追加ファイル1: 図S8）。 しかし、96時間では、細胞が細胞分裂のどの世代にあるかにかかわらず、IL4発現の差は重要ではなくなっている。 このことから、IRE1a阻害による増殖の遅延は、IL4発現の抑制には十分でないことが示唆された。 一方、IL13-GFPでは、第一世代からIL13の発現が低下し、それが後の世代まで続いていることが観察された（Additional file 1: Figure S9）。

IRE1a阻害は、S期およびG2／M期を通じた細胞周期進行を遅らせる

異なる発現遺伝子（Th2対4μ8c処理Th2）およびXBP1直接標的遺伝子のバイオインフォーマティクス分析により、異なる段階（すなわち、細胞周期進行の制御に関与するいくつかの遺伝子も明らかになった。 G1、S、G2/M)を経て細胞周期進行の制御に関与するいくつかの遺伝子が、発現量の多いグループと少ないグループに分類された（図8a）。 4μ8c処理Th2で未処理Th2と比較して発現が異なる遺伝子（調整p値< 0.05）（Fig. 8a, left, Additional file 9: Table S8）とXBP1直接標的遺伝子で発現が異なる遺伝子（図8a, right, Additional file 10: Table S9）を取り出し、異なる細胞周期ステージで既知の役割について、RNA-seqデータに基づいて手動でキュレートしたリストか公開データベースのいずれかを用いてチェックした。 その結果、すべての細胞周期ステージ（すなわち、G1、S、およびG2/M）から多くの遺伝子が影響を受けていることがわかった。 IRE1a-XBP1経路が制御する細胞周期ステージを特定するために、mCherryタグのCdt1とmVenusタグのGemininタンパク質を発現するトランスジェニックFUCCI (fluorescent ubiquitin cell cycle indicator) マウス株を作成し、使用しました。 この系統は、.NETで使用されているものと類似している。 G1細胞はmCherry+ mVenus- (Q3; Fig. 8b), G1-S細胞はmCherry+ mVenus+ (Q2; Fig. 8b), SG2MはmCherry- mVenus+ (Q1; Fig. 8b), 分裂中およびG1入りした細胞はmCherry- mVenus- (Q4; Fig. 8b)であることがわかった。 T細胞活性化中のビヒクル処理と4μ8c処理したTh2細胞の細胞周期プロファイルを比較したところ、4μ8c処理したTh2細胞の細胞周期プロファイルは、4μ8c処理したTh2細胞の細胞周期プロファイルと同じであった。 その結果、IRE1a-XBP1経路が遮断されると、細胞がS期および／またはG2／M期に蓄積されることが分かった（図8b）。 同様の結果は、DAPI染色を用いたBrdU取り込みアッセイを用いた別のアプローチでも得られた（追加ファイル1：図S10）

IRE1a 阻害は、S期およびG2/M期の細胞周期進行を遅らせる。 a 左パネル：4μ8c処理および未処理Th2トランスクリプトームにおいて差次的に発現した細胞周期段階関連遺伝子のヒートマップ。 右図：細胞周期に関与することが知られているXBP1直接標的遺伝子のヒートマップ。 b mCherryタグCDT1およびVenusタグGEMININを発現するFUCCIマウスを用いた、72時間活性化後のTh2リンパ球の細胞周期解析。 左上：使用したFUCCIマウスの細胞周期ステージを図式化したもの。 右上：Th2と4μ8c処理Th2（n = 6）の細胞周期の異なるステージから得られた細胞（全体の％）の比較。 下段。 CDT1およびGEMININ発現細胞を示すTh2および4μ8c処理Th2の1つの代表的なFACSプロファイル

XBP1sのトランスジェニック発現は、IRE1aエンドヌクレアーゼ活性の4μ8cによる阻害を補う

観察された4μ8c処理表現型がXBP1sの喪失に起因するかどうかを調べるために、4． XBP1s発現ベクターをin vitroでTh2細胞に導入し、相補性アッセイを実施した。 このベクターは、IRE1aの機能とは無関係なXBP1のスプライシング型（XBP1s）をコードしていた。 XBP1sの安定な異所性発現は4μ8c処理の効果を無効にし、Th2細胞がXBP1sを過剰発現しても4μ8c処理によるトランスクリプトームの有意な変化がないことがわかった（追加ファイル1：図S11A）。 XBP1sを過剰発現しているTh2細胞は、4μ8cの存在下で正常に増殖・分化した（それぞれ追加ファイル1：図S11BおよびS11C）。 これらの結果は、4μ8c処理時に観察される表現型が、XBP1sの消失に起因することを強く示唆するものである

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