Establishment of Human Gastric Cancer Xenograft Model in Immunocompetent Mice Using Microcarrier-6
Abstract
胃がんは消化管の悪性腫瘍の中で最も多いものの1つである． 癌の病態を研究するためには，頑健で信頼性の高い動物モデルを確立することが基礎となる。 本研究では、マイクロキャリアーを用いて免疫担当マウスにMKN45細胞を接種し、胃がんモデルマウスを樹立した。 C57BL/6雄性マウス60匹を、MKN45とマイクロキャリアの共培養系に応じて、2D群、空キャリア群、3D群の3群に無作為に分けた。 皮下注射によりモデルマウスを樹立した。 各群で腫瘍発生時間、腫瘍形成率、病理学的特徴を観察した。 3D群では、腫瘍形成時間は短く、腫瘍形成率は高かった（75%）。 2D群および空担体群では、検出可能な腫瘍形成は見られなかった。 腫瘍の異種移植片のH&Eおよび免疫組織化学的染色の両方が、ヒト胃の新生物の特徴的な証拠を示した。 本研究により、免疫不全マウスにおけるヒト胃がんモデルの確立に成功し、がん研究および抗がん剤開発のための新規かつ貴重な動物モデルを提供することができた
1. はじめに
毎年約100万人が新たに診断される胃がんは、世界中の人々の健康と生命に深刻な脅威を与えている 。 しかし、胃がんの病態や転移のメカニズムはまだ完全には解明されていません。 胃がんのin vivoモデルは、胃がんの生物学的特徴や新規治療法の可能性を探るために不可欠なツールです。 ヒト由来の胃がん異種移植モデルは、ヌードマウスや重症複合免疫不全マウスなどの免疫不全マウスで確立されています。 しかし、免疫不全マウスは飼育が容易でなく、コストもかかる。 重要なことは、免疫不全マウスは、腫瘍の発生と進行における免疫系の重要な役割を反映していないことである。 従って、正常な免疫系を持つマウスを用いた新しいヒト胃がん異種移植モデルの確立は、非常に重要な意義があります。 本研究では、MKN45、ヒト胃がん細胞、マイクロキャリアを共培養し、その懸濁液を免疫担当マウスに接種し、新規ヒト由来胃がん異種移植片の樹立に成功した
2． 材料
Roswell Park Memorial Institute- (RPMI-) 1640培養液、トリプシン、牛胎児血清、ペニシリンはGibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)から購入した。 ウサギ抗ヒト糖質抗原199（CA199）、サイトケラチン7（CK-7）、および尾状型ホメオボックス2（CDX-2）モノクローナル抗体はAbcam（Cambridge、UK）から購入した。 マイクロキャリア-6はElyon Biotechnologies LLC (Gaithersburg, MD, USA)から購入した
2.2. 実験動物＜4025＞＜8341＞体重22〜25gの6〜8週齢の雄のC57BL／6マウス60匹を、Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co. (ライセンス番号：SCXK 20140007、中国山東省）から購入し、済寧医科大学附属病院（中国山東省）の特定病原体不検出動物センターで飼育した。 すべての動物実験は、済寧医科大学附属病院機関動物管理使用委員会の承認を得て、承認されたガイドラインに従って実施した
2.3. 細胞株
MKN45ヒト胃がん細胞株は、Cell Bank of the Chinese Academy of Science（中国、上海）から購入し、10％ウシ胎児血清および100 U/mLペニシリンを含むRPMI-1640培地で、37℃、5％CO2で培養を行った。 培養液は24時間ごとに交換し、0.25%トリプシンによる消化で細胞を採取した
2.4. マイクロキャリア-6を75%エタノールに24時間浸し、1xリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、RPMI-1640培地で24時間インキュベートした後、間質細胞由来因子-1α（SDF-1α）および血管内皮増殖因子（VEGF）、いずれも100 ng/mLで3時間インキュベーションしてマイクロキャリア-6の改良に努めた。 対数増殖期の細胞はトリパンブルー染色後にカウントし、生存率が＜707＞95％になったときの濃度に調整した。 MKN45細胞懸濁液を修飾マイクロキャリア-6と混合し、さらに5% CO2、37℃で24時間インキュベートして細胞をマイクロキャリアで飽和させ、顕微鏡で観察した（図1（c）および図1（d））。
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を参照。
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2． 動物群分け
60匹のC57BL/6マウスを無作為に3群（1群20匹）に分けた：2次元（2D）群（含有物を接種した動物）、空担群（30μgマイクロキャリア-6を含有物を接種した動物）、3次元群（含有物と30μgマイクロキャリア-6を接種した動物）
2.6. 動物モデル作製＜4025＞＜8341＞実験初日に3D腫瘍細胞培養モデルを確立し、24時間培養した。2日目に、培養した細胞-マイクロキャリア複合体をで3回洗浄し、穏やかに混合して細胞と1mL当たり300μgマイクロキャリア-6に濃度を調整し、後に使用するために氷上に置いた。 対数増殖期のMKN45細胞を収穫し、トリプシン処理し、 で3回洗浄し、 で再懸濁し、後で使用するために氷上に置いた。 改良型マイクロキャリア-6は、 で3回洗浄し、300μg/mL の濃度で再懸濁し、後で使用するために氷上に置いた。 3つの実験グループの各マウスに、対応する溶液100μLを右腋窩の下に接種した
2.7. 指標検出および病理学的検査
接種後、マウスを群ごとに分けて収容し、毎日の食欲、活動、および体重を観察した。 各マウスの局所腫瘍形成時間および腫瘍体積を記録した。 腫瘍が確認されたら、各腫瘍の長径（a）と短径（b）を毎日測定し、腫瘍体積の式： .に従って腫瘍体積を算出した。 腫瘍を有するマウスは3回に分けて犠牲にした。 接種後10日目、20日目、30日目。 各マウスから腫瘍組織を完全に摘出し、腫瘍の質、感触、浸潤と壊死の程度を記録した。 続いて、腫瘍組織を4％中性緩衝ホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色した。 免疫組織化学にはEnVision 2段階染色法を使用した。 染色結果は、腫瘍の顆粒状細胞質染色が陽性であることを基準に判断した。 陰性（-ve）染色は＜6796＞5％の陽性染色細胞、陽性（＋ve）染色は＜4567＞5％以上の陽性染色細胞と定義された。 統計解析
SPSS 13.0 ソフトウェア (IBM SPSS, Chicago, IL, USA) を統計解析に使用した。 測定データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として示した。 各群の平均値間の差は、適宜、一元配置分散分析（ANOVA）またはクラスカル・ワリス検定を使用して比較した。 は、統計的に有意な差とみなす
3. 結果
3.1. マイクロキャリア-6を用いた体外MKN45 3次元腫瘍培養システムの構築
マイクロキャリア-6は、正帯電性有機ポリマーを多層多孔質構造にした新規マイクロキャリアである。 マイクロキャリア-6は、化学合成により細孔径、正表面電荷密度、大きさを調整することが可能である。 C型マイクロキャリア-6は、体積が小さく、孔径が大きく、何度も空間を折り畳むことができるため、主に3次元細胞培養や薬剤感受性実験に用いられている（図2（a）、2（b））。 M型マイクロキャリア-6は、体積が大きく、孔径が小さく、内部折り畳み回数が少ないため、主に組織工学研究に用いられる（図2（c）、図2（d））。 本研究では、C型マイクロキャリア-6を使用した。 このマイクロキャリア-6は、純粋な有機化合物であり、不純物がなく、免疫原性や代謝が低く、生体適合性が高いため、細胞の増殖に安定した微小環境を提供します（図2（a）-2（d））。 また、マイクロキャリア-6をマウスの皮膚に直接埋め込むことで、血管の生着を誘導し（図2（e）、2（f））、腫瘍細胞の増殖に十分な血液を供給することができる。 MKN45細胞は2次元環境下で急速に接着し、24時間培養後の顕微鏡で観察された細胞形態は不規則な多角形を呈していた（図1(a)）。 また、マイクロキャリア-6は、不規則あるいは長紡錘形の形状を示し、緩い感触であった（図1(b))。 MKN45と改良型マイクロキャリア-6を24時間共培養したところ、MKN45細胞はマイクロキャリアによく接着し、コンフルエンスに達した。 また、マイクロキャリア-6に接着したMKN45細胞の周囲には、不規則な細胞集団が観察された（図1（c））。 MKN45細胞-マイクロキャリア複合体を4,6-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI）溶液で染色したところ、マイクロキャリア-6の足場に多数のMKN45細胞が接着していることがわかった（図1(d))。 マイクロキャリアの多層多孔質構造は、走査型電子顕微鏡で観察することができる（図1(e)）。 MKN45細胞はマイクロキャリアに接着し、表面に接着した細胞は細胞クラスターを形成した（図1(f)）。
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図2
3.2. マウスの生存率と腫瘍形成
実験中、食欲、毛並み、体重に各群で大きな変化は見られなかった（表1）。 3D群のマウスは接種後1週間でわずかに活動性が低下した。 30日間の実験期間中、いずれの群でも死亡した動物はなく、空担体群および2D群でも腫瘍の形成は認められなかった。 3D群では20匹中15匹のマウスの皮下腫瘤が接種後7-10日目に触診で確認され、腫瘍形成率は75%であることが示唆された（Table 1）。 腫瘍異種移植片は急速に成長し、接種から約10日後に皮下腫瘤として観察された（図3（a）、補足図3）。 腫瘍異種移植片は、接種後2〜3週間で0.5〜1.0cm3の大きさにまで成長した。 腫瘍異種移植片の組織は、隣接する組織から容易に分離され、比較的規則的な形状を呈し、ほとんどが円形または楕円形で、色は灰白色または灰赤色であり、豊富な末梢血液を供給した（図3（b）、図3（c）、補図3）。 空担群では注入部位の組織学的変化が見られたが、2D群では変化が見られなかった（図3（d）、図3（e））。 空担群では皮下の小さな腫瘤が黄色く観察された（図3(d)）。
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3.3. H&E Staining
光学顕微鏡で見た組織形態学では、3Dグループのマウスの腫瘍異種移植片に多数の無秩序で異型の細胞が見られた（図4（a）-4（c））。 接種後10日目には、多数の異型細胞、残留マイクロキャリア、豊富な血管が観察された（図4(a)）。 接種後20日目には、少数の残存マイクロキャリア（図4(b)）と多数の壊死病巣（図4(d)）が観察された。 しかし、接種後30日目には、マイクロキャリアが大幅に消失した（図4(c)）。 空担体群では、多数のマイクロキャリアと少数の炎症性細胞が観察されたが、腫瘍細胞は認められなかった（図4(e)）。
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3.4. 免疫組織化学
免疫組織化学は、腫瘍異種移植の20日後に安楽死させた動物で実施された。 腫瘍移植組織は、CA199、CK-7、およびCDX-2染色が陽性であり（図4（f）-4（h））、非定型細胞がヒト由来の腫瘍細胞であることをさらに確認した。 議論
動物モデルは、胃癌の発症および転移機構の研究に広く用いられており、治療薬の有効性および毒性の評価において非常に重要な役割を担っている . 現在、胃癌の動物モデルには、主に誘導モデル、移植モデル、遺伝子工学モデルがある。 このうち、移植モデルは操作が容易であるため、広く用いられています。 異種移植モデルの成功には、実験動物の種類、腫瘍の異種移植片、移植の部位や経路が影響すると考えられてきました。 異種移植モデルには、ヌードマウスや重症複合免疫不全（SCID）マウスなど、免疫機能に欠陥のあるマウスが一般的に使用されています 。 しかし、免疫不全マウスは比較的高価であること、寿命が短いこと、腫瘍に対する免疫反応がないことなどから、免疫不全マウスの欠点を回避するために、我々は異種移植モデルに免疫不全のC57BL/6マウスを選択した。 一般に、胃がんの発生はエストロゲンのレベルとは無関係と考えられており、雄の胃がん発生率は雌より高いとされています。 そこで、モデルとして雄マウスを使用した。 また、本研究では、主に浸潤性・転移性の強い細胞株であることから、MKN45ヒト胃がん細胞を用いてin vitroモデルを構築しました . さらに、腫瘍細胞の移植部位および移植経路として、それぞれ脇の下の皮下領域および異所性移植を選択した。これは、この領域が豊富な血液供給と緩い組織構造を持っており、マウスでの腫瘍増殖が容易であるためである
2D 細胞培養システムと動物モデルの間の橋渡しとして、3D 細胞培養システムにより腫瘍細胞増殖の微小環境をよりよく模擬し、現在の研究において魅力ある話題となっている . 癌細胞の3次元培養は腫瘍オルガノイドを形成し、腫瘍オルガノイドを用いたマウス腫瘍異種移植モデルは抗癌剤のスクリーニングに応用され始めている。 本研究では、新規のマイクロキャリア-6とMKN45細胞を用いて共培養実験を行い、3次元増殖モデルの確立に成功した。 マイクロキャリア-6をマウスの皮下組織に直接埋め込み、血管がマイクロキャリアに入り込むようにすることで、他のマイクロキャリアでは得られない特異的な利点を提示した。 これまで、ヒト腫瘍細胞に対する抵抗性を獲得するために免疫不全マウスを軽度免疫抑制し、担癌マウスモデルの確立に成功したという報告がありますが、非免疫抑制下で正常マウスにヒト腫瘍を異所的に移植することに成功したという報告はありません。 また、MKN45細胞の濃度を調整し、100μLのMKN45細胞懸濁液を直ちに各マウスに皮下投与したところ、異所移植されたヒト腫瘍細胞に対する免疫クリアランスが強く、安定した腫瘍形成は達成されませんでした。 本研究で使用したマイクロキャリア-6は、免疫原性が低く、中央部に多数の孔を有する緩いテクスチャーであるため、腫瘍細胞の増殖が容易であることが確認された。 また、このマイクロキャリア-6は、免疫細胞が腫瘍細胞を直接殺傷するのを阻止するバリアーとしても機能した。
細胞性免疫は腫瘍の成長に対する主要な軍隊であり、関与する細胞には主にT細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および樹状細胞が含まれる. マイクロキャリア-6は不規則な「迷路」のような構造をしているため、短期的なバリアとして機能し、免疫細胞による腫瘍細胞の直接殺傷をある程度まで阻止することが可能である。 さらに、実験の3時間前に、マイクロキャリア-6をSDF-1αとVEGFでさらに修飾し、血管形成を促進させ、急速な腫瘍増殖のための血液供給を行い、マウスの抗腫瘍免疫効果を凌駕することができた。 同時に、マウスの末梢血や脾臓組織のマクロファージが、移植腫瘍形成の初期に、正常対照群に比べ有意に減少していることを見出した（補足図1）。 骨髄マクロファージ数は、空担体群、2D群、3D群の間で徐々に減少したが、統計的有意差はなかった（補足図2A、2B）。 空担体群と比較して、2D群では脾臓Tリンパ球の数が減少したが、統計的有意差はなかった（補足図2C）。 3D群では2D群に比べ、脾臓Tリンパ球の数が有意に減少した（補足図2C）。 このことから、腫瘍の増殖が免疫系を阻害し、腫瘍の急速な増殖を可能にしたと考えられる。
本研究では、MKN45細胞の3次元増殖モデルを確立し、2D群および空キャリア群のマウスが腫瘍を形成しなかったのに対し、3D群では免疫無能力マウスでヒト胃がん異種移植モデルを確立させることに成功した。 この異種移植モデルの特徴は、腫瘍の成長が速いことで、接種後7-10日で手で触診でき、接種後10-15日で至適成長に達し、接種後約20日で腫瘍体積は0.5-1.0 cm3となりました。 H&E染色により，筋肉や脂肪組織に浸潤した核異型性を有する細胞が多数検出された。 残存したマイクロキャリア-6は炎症性細胞に囲まれ，中央に大きな壊死域を持つ肉芽腫を形成していたが，これは腫瘍の急速な増殖による血液供給不足が原因であると思われた。 これらの現象は、ヒトにおける腫瘍の発生と一致する。 さらに、豊富な毛細血管は主に腫瘍の周辺部に位置していた。 現在，胃癌に特異的な腫瘍マーカーはないが，CA199，CK-7，CDX-2は消化器系腫瘍のマーカーとして一般的に使用されている． そこで、ヒト由来の胃がん細胞の標識・同定に、これら3つのマーカーを選択した。 CA199, CK-7, CDX-2の免疫組織化学的染色は陽性であり，異型細胞がヒト胃癌細胞であることがさらに確認された
5. 結論
我々は、免疫不全マウスにおけるヒト胃癌異種移植モデルの確立に成功した。 このモデルは、身体の免疫系と腫瘍の間の相互作用を反映することができ、腫瘍免疫の将来の研究だけでなく、新薬の研究開発に広い応用の見通しを持っている。
データの利用
この研究の結果を支持するために使用したデータは、リクエストに応じて対応する著者から入手できます。
利益相反
著者は利益相反がないことを宣言する。
著者の貢献
Yanzhenビ、Quanyiワン、およびYonghongヤンはこの仕事に等しく貢献しました。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（81170395および81570556）、吉林省自然科学基金（20180101137JCおよび20180101130JC）および林和の学術ワークステーション新薬と臨床翻訳の研究基金（JYHL2019FMS21）から助成を受けたものである。
補足資料
炎症細胞の変化とその他の腫瘍形成のデータです。 補足図1：移植腫瘍形成の初期段階における担癌マウスの炎症細胞の変化。 補足図2：移植腫瘍形成の初期における各群の炎症細胞の変化。 補足図3：担癌マウスと移植腫瘍組織。 (補足資料)