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除草剤変換における白色腐朽菌の役割

白色腐朽菌による除草剤の変換

農薬を含む広範囲の汚染物質がWRFによって変換・分解されることは良く知られている。 ペンタクロロフェノール、イソプロツロン、イソキサフルトールの誘導体、アトラジン、シマジン、プロパジン、リンデン、アトラジン、ジウロン、テルブチラジン、メタラキシル、DDT、ディルドリン、アルドリン、ヘプタクロール、クロルデン、などである。 . このリストは、WRFがさまざまな種類の汚染物質に対して分解能力を持つという強力な証拠があるため、さらに拡大される可能性があります。 WRFによる除草剤の分解に関するデータの一部を表2にまとめました。 多くの研究が、液体培地の定置条件と固体系発酵条件を用いて行われたことを言及すべきです。 しかし、除草剤分解のレベル、この手順におけるリグニン分解酵素の役割、分解のメカニズムについては、矛盾したデータも存在する。

テルブチルアミン

Coriolus versicolor Atrazine6767

Pleurotus ostreatus

Trametes versicolor

除草剤 栽培 消滅。
種類 日数
アグロシベ(Agrocybe semiorbicularis Atrazine Stat 42 40
ジウロン 42 70
テルブチルアミン 4260
Auricularia auricola Atrazine Stat 42 16
Diuron 42 10
42 42 16 42 37
Cerrena maxima Atrazine Sub 40 83
Cerrena maxima&
Cororiolus アトラジン
サブ 40 78
Coriolopsis fulvocinerea Atrazine Sub 40 88
Coriolus hirsutus Atrazine Sub 40 91
Coriolus versicolor Atrazine Stat 91 42 86
Chloronitrofen 12 30 32
Diuron 42 99
ニトロフェン 12 80
ターブチルアミン 42 1967 63
Dichotomitus Squalens Atrazine Stat 42 25
Diuron 42 21
テルブチルアミン 42 52
フラムルイナ velupites Diuron Stat 42 6
Terbuthylazine 42 30
Ganoderma lucidum Bentazon (5 mM) Stat 10 88
Bentazon (20 mM) 10 55
Bentazon (50 mM) Sol 10 90
Diuron (30 μM) Stat 1055 0
Picloram 10
0 10
Hypholoma fasciculare Atrazine Stat 42 57
ジウロン 42 71
ターブチルアミン42 97
Phanerochaete chrysosporium Atrazine Stat 14 0
Stat 10 060
42 20
Bentazonソル 33 55
20 65
ジケトニトリル(イソキサフルトールの誘導体) Stat 15 42
ジウロン Stat 10 94
42 3
Isoproturon Bio-…ベッド 28 78
100 >99
MCPA Sol 20 75
Propazine 8 45
Simazine 8 5
テルブチルアジン 42 53
8 95
Atrazine Stat 42 15
Diuron 42 12
Terbuthylazine 30
Stereum hirsutum Atrazine Stat 42 57
Diuron 42 80
Terbuthylazine 42 88
Trametes sp. Picloram Stat 10 0
Diketonitrile (イソキサフルトールの誘導体) 15 34

表2.

白色腐朽菌による除草剤の分解

Stat – 液体媒体上での定常状態

Sub – 液体媒体上での沈降培養

Sol – 固体培養

いくつかの菌がある. Agrocybe semiorbicularis, Auricularia auricula, Coriolus versicolor, Dichomitus squalens, Flammulina velupites, Hypholoma fasciculare, Pleurotus ostreatus, Phanerochaete velutina, Stereum hirsutum などはアトラジンやジウロン、テルブチラジンといった各種除草剤を異なる効率で分解できる能力を示している。 Coriolus versicolor、Hypholoma fasciculare、Stereum hirsutumは6週間で86%以上のジウロン、アトラジン、テルブチルアジンを分解した。 また、リグニン分解酵素の産生も最も活発であった。 しかし、WRFの芳香族系除草剤であるジウロン、アトラジン、テルブチルアジンの分解能力は、リグニン分解活性の指標として用いられるポリR-478脱色試験で求めたリグニン分解活性と相関がなかった。 これらの結果から考えられることは、液体培養した菌類が作り出すLMEパターンの違いである。 圃場試験において、最も効果的なS. hirsutum株は除草剤分解に不活性であり、他のC. versicolorとH. fasciculare株は6週間で30%のクロロピリホス分解を示したのは興味深いことである .

白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporiumとTrametes versicolorは液体培地上で静置した状態で15日後にジケトニトリル(除草剤isoxaflutolの土壌変化物)を最大35-40%不活性安息香酸アナログに変換した. 発酵中に生産されたラッカーゼなどのリグニン分解酵素のレベルは、除草剤の分解と相関しているようであり、分解プロセスにおけるこれらの酵素の役割を確認することができた。 しかし、2,5-キシリジン添加によるラッカーゼ産生の6倍誘導は、ジケトニトリル切断の有意な増加をもたらさないことを強調した。

Coriolus hirsutus, Cerrena maxima, Coriolopsis fulvocinerea、およびCoriolus hirsutus/Cerrena maxima共培養が沈積栽培でアトラジン分解を行い、40日栽培で77-91%の除草剤を分解することを明らかにした。 また、菌糸体へのアトラジンの吸着はごくわずかであった。 また、ラッカーゼ活性が高く、本菌によるアトラジンの分解にラッカーゼが関与している可能性が示唆された。 この仮説は、ラッカーゼ誘導剤(グアヤコールおよびシリンガルデジン)存在下での水中栽培によるアトラジン分解の研究によって支持された。

平塚らは、Coriolus versicolor IFO 30340が液体培地を用いた定常培養で12日後にクロロニトロフェン(CNP)を30%、ニトロフェン(NIP)を80%分解することを報告している。 除草剤分解率は培地中の窒素濃度に依存し,低窒素条件下で高くなったことから,リグニン分解系が除草剤分解に関与していることが示唆された。 しかし,LiP,MnP,ラッカーゼおよび培養ろ液は除草剤を酸化しなかった。 また、ラッカーゼの酸化還元剤として知られるHBTを用いたラッカーゼ-酸化還元剤系では、クロロニトロフェンもニトロフェンも酸化されなかった。 これらの結果から,Coriolus versicolor IFO 30340によるCNPおよびNIP分解の初期段階には,細胞外リグニン分解酵素は関与していないと結論づけた。 C. versicolorによるCNPおよびその中間体の代謝過程で生成される生成物を順次同定することにより,著者らはCNPの分解経路として,芳香族水酸化,酸化的脱塩素化,還元的脱塩素化,ニトロ基のアミンへの還元の4種類を提案することが可能となった。 芳香族水酸化による2,4,6-トリクロロ-3-ヒドロキシ-4′-ニトロジフェニルエーテルと酸化的脱塩素化による2,4-ジクロロ-6-ヒドロキシ-4′-ニトロジフェニルエーテルはP450阻害剤のピペロニルブトキシドにより効率的に停止されるので、シトクロムP450型酵素による触媒作用があると推定された。 Coriolus versicolor IFO 30340によるCNPからNIPへの変換は還元的脱塩素化であることが予想される。 P. chrysosporium によるペンタクロロフェノールの分解には還元的な脱塩素化反応が関与していた。 また,C. versicolor による CNP は 2,4,6-trichloro-4′-aminodiphenyl ether に変換された. また、CNP分解の初期反応として還元的脱塩素化反応とニトロ還元反応が認められ、これらはチトクロームP450阻害剤の添加により促進された。 NIPの菌体変換では、芳香族水酸化反応と酸化的脱塩素化反応も観察された。 2, 4-ジクロロ-3-ヒドロキシ-4′-ニトロジフェニルエーテルまたは2, 4-ジクロロ-6-ヒドロキシ-4′-ニトロジフェニルエーテルと2-クロロ-4-ヒドロキシ-4′-ニトロジフェニルエーテルまたは2-ヒドロキシ4-クロロ-4′-ニトロジフェニルエーテルのいずれかであろうことが推測された。 また,NIPの菌体変換はpiperonyl butoxideによって効果的に阻害された。

得られた結果から,著者らは,シトクロムP450が環境中に残留する芳香族のイオン化ポテンシャルを下げ,リグニン分解性一電子酸化酵素が効率的に分解するための適切な基質を提供するという重要な役割を果たすと仮定した. ジフェニルエーテル,4-クロロジフェニルエーテル,4-ニトロジフェニルエーテルを菌体培養に添加すると,それぞれ4-hydroxydiphenyl ether,4-chloro-4′-hydroxydiphenyl ether,4-nitro-4′-hydroxydiphenyl etherが主要生成物として同定された. 4-クロロジフェニルエーテルと4-ニトロジフェニルエーテルからはそれぞれ4-クロロフェノールと4-ニトロフェノールが微量に検出されたが、対応するヒドロキノンは観察されなかった。 これらのデータは、CNPのA環またはB環からのフェノール生成物の生成は別の経路を経由しており、直接エーテル開裂は起こっていない可能性を示唆するものであった。

Ganoderma lucidumは除草剤diuronとbentazonに対して耐性を示し、上限はそれぞれ80μMと20mMであった。 この結果は、ジウロンに変換される際に生成される代謝物の毒性が高いためと考えられる。 ジウロンの菌体変換で生成される代謝物の中には,親化合物よりもさらに毒性の高いものがあることは,以前に報告されている。 G. lucidumは液体培養で10日間培養した後、55%のジウロンと88%のベンタゾンを効率的に除去することが可能であった。 ベンタゾンとジウロンは、2つのラッカーゼアイソフォームのうち1つを誘導し、菌のラッカーゼ産生を強く向上させることがわかった。 細胞外酵素のネイティブPAGE解析から、除草剤に対するラッカーゼ活性の向上は、新しいラッカーゼの発現によるものではなく、非誘導培養において既に存在するアイソフォームの過剰生産によるものであることが明らかとなった。 また、Trametes versicolor と Abortiporus biennis においても、第四級窒素除草剤であるパラコートの存在下で、構成的なラッカーゼが過剰に生成されることがわかった。 G. lucidumの細胞外酵素を電気泳動で解析した結果、非誘導条件下ではラッカーゼ1が優勢であることがわかった。 また、除草剤によりラッカーゼ2のみが誘導され、ラッカーゼ1が抑制された。 このことから、ラッカーゼ2が菌の防御系により強く関与していることが示唆された。

コーンコブを基質とした液体培養および固体培養によるGanoderma lucidumの除草剤Bentazon分解に関する比較研究を行った。 液体培養に比べ、固体培養では除草剤に対する耐性が高く、分解効率も高かった。 それぞれ、20 mM に対して 50 mM、55 %に対して 90 %であった。 著者らは、不溶性基質であるコーンコブに除草剤が吸着しているため、除草剤の利用率が低いこと、液体培養ではラッカーゼ活性が高いのに対し、固体培養ではラッカーゼとMnペルオキシダーゼ活性が高いことの2点について、相互に排他的ではないものの、可能な説明を提示している。 しかし、水溶性抽出物とメタノール抽出物を合わせた抽出物からは、代謝産物が検出されなかった。 また、G. lucidumの粗濾液にラッカーゼとMnペルオキシダーゼが含まれており、in vitroでベンタゾンを分解することが示された。 Mn2+、ABTS、Tween 80、H2O2を添加した実験では、ベンタゾン分解に相乗効果が見られ、ラッカーゼとMnペルオキシダーゼの両方が分解に関与していることが示唆された。 ABTSはリグニンの非フェノール化合物の酸化を媒介し,不飽和脂肪酸(Tween 80)の存在は,脂質ペルオキシラジカルやアルコキシラジカルの生成によりMnペルオキシダーゼやラッカーゼの触媒による酸化過程を改善することがよく知られている ………………………………………………………… Mnペルオキシダーゼとラッカーゼが生成した脂質ペルオキシラジカルまたはアルコキシラジカルが存在すると、MnペルオキシダーゼはMn2+をMn3+に酸化し、これがベンタゾンを酸化し、ラッカーゼはABTSを酸化媒介としてベンタゾンの酸化を行う、という仮説的機序が成り立つと思われた。 しかし、ピクロラムは芳香環の置換度が高いためか、液体培養ではG. lucidumとTrametes sp.の分解は観察されなかった。 この除草剤は,Trametes sp.のラッカーゼ産生を促進したが,G. lucidumの酵素産生は抑制された。 著者らは、ピクロラムが細胞内に侵入した後にmRNAレベルで酵素産生が阻害されるか、分泌の前後に酵素が修飾されることで酵素産生が阻害される可能性があると想定した。 G. lucidumとTrametes sp.のピクロラムへの暴露は、両菌による除草剤の一過性の生物濃縮という特異なメカニズムを明らかにした

最も研究されているWRFはP. chrysosporiumで、異なる条件下で広範囲の除草剤を分解することが明らかにされた。 MCPAとベンタゾンはP. chrysosporiumによって20日間でそれぞれ65%と75%分解された。 P. chysosporiumはフェニルウレア系イソプロトロン、アトラジン、ジウロンも分解した。 しかし、液体培養では、アトラジンの分解は認められなかった。 また、P. chrysosporiumの分解効率は液体培養に比べ固体培養で高かった。 除草剤の分解機構として、リグニン分解酵素の作用と細胞内酵素(特にシトクロムP450)の作用の2つが提唱された。 P. chrysosporiumによるジウロンの分解について、生成物の同定とシトクロムP450の役割の評価を含めて研究した。 その結果、新鮮な菌糸体中に相当量のジウロン、DCPMU、DCPUが存在すること、チトクロームP450阻害剤であるABT(1-アミノベンゾトリアゾール)によりジウロン分解が阻害されることの2点が重要であった。 これらの結果から,本除草剤の細胞内分解機構は,N-脱メチル化であることが確認された。 しかし,5日後のDCPMUおよびDCPUの濃度は,菌糸体抽出物よりも培養ろ液の方が高かったことから,これらの代謝物の分解には糊化酵素が関与している可能性が示唆された。 da Silva Coelho-Moreiraらは、ベラトリルアルコールH2O2とMn2+を組み合わせた酵素粗抽出液では除草剤が分解されなかったことから、DCPUとDCPUはMnPによってさらに変換される可能性があるとした

P. chrysosporiumもアトラジンやその変換産物、その他のs-トリアジン除草剤の変換に関与できる。 この菌による塩素化s-トリアジン分解経路の最初の主要ステップは、モノ-N-脱アルキル化であった。 ヒドロキシアトラジンは、アトラジンで処理した土壌や液体培養で検出される主な分解生成物であった。 P. chrysosporiumはヒドロキシアトラジンを未知の化合物に活発に変換し、培地中に蓄積した。 P. chrysosporiumによるアトラジンのモノN-脱アルキル化には、2位のアルキル基と塩素の両方が必要であることが明らかになった。 従って、液体培養における脱エチルヒドロキシアトラジンの生成は、脱エチルアトラジンの加水分解に起因するものと思われる。 テルブチルアジン、アトラジン、シマジンの実験でも、エチル側鎖の除去が優先反応であり、第2アルキル基の質量に依存する可能性があることが示されている。 言い換えれば、一方のアミノ置換基に結合した質量の大きい基を持つ化合物は、他方の鎖に影響を与えるN-脱アルキル化がより進むと考えられる。 対称的な化合物であるプロパジンとシマジンも、アトラジンに比べて遅い速度で分解された。 LiPとMnPのいずれもアトラジンとそのN-脱アルキル化代謝物を変換しなかった。 また、チトクロームP450阻害剤存在下では、アトラジンのN-脱アルキル化が減少することが示された。 さらに、除草剤の分解は菌糸体によってサポートされた。 したがって、アトラジンの分解にチトクロームP450が関与していることが推測された。 これらのデータは,これまでに発表されたPleurotus pulmonariusによるアトラジン分解の研究結果と一致し,リポキシゲナーゼ,ペルオキシダーゼ,シトクロムP-450などの酵素が関与していることが明らかとなった。 これらの酵素を活性化するMn2+はアトラジンのN-脱アルキル化およびプロピルヒドロキシル化代謝物への変化を促進したが、抗酸化剤、リポキシゲナーゼおよびペルオキシダーゼの阻害剤(ノルジヒドログアヤレチック酸)およびシトクロムP-450(ピペロニルブトキシド)はその分解を抑制することがわかった。

表2に示したデータを解析するために、除草剤の消失率を分解期間(日)に対する消失率(%)として算出し、その後、各除草剤について平均値を算出した(図1)。 なお、菌類による除草剤分解に及ぼす栽培条件の影響を考慮し、液体培地上での定常状態のデータのみをこのように扱った。

図1.

除草剤の消失率とその構造の関係

本研究で得られた結果は、P. chrysosporiumによるs-トリアジン系除草剤のモノN-脱アルキル化分解にはアルキル基の存在が必要であることを確立した研究とよく対応しています。 さらに、WRF菌のs-トリアジン分解能力は、正確に分岐したアルキル基の量が増加するにつれて向上するようである。 しかし、この予備的な観察結果を証明または反証するためには、詳細な定量的構造-分解活性研究を実施する必要がある。 このことは,ニトロフェン(塩素1個)とクロルニトロフェン(塩素3個)の分解速度の比較から,また塩素を含まない唯一の除草剤であるベンタゾンの分解速度が最も高いことからわかる(Fig.1)。 したがって、Fig. 1に示されたデータは、さらなるQSAR研究の必要性を明確に示しています。 除草剤分解の主な酵素経路に関する知識とともに、QSARを実施することにより、構造が既知の除草剤に対するWRFの分解能力の予備的評価が大幅に改善される。 そこで,個々のリグニン分解酵素,それらの混合物,および酵素-酸化還元メディエータ系の除草剤分解効率に関するデータを表3にまとめた。 このように、P. chrysosporium、Trametes versicolor、Coriolus versicolorのMnPおよびLiP粗抽出物と精製酵素は、酸化還元剤存在下でもジケトニトリル、ジウロン、アトラジン、クロロニトロフェン、ニトロフェン、グリホサートの分解は観察されなかった …。 しかし、P. chrysosporiumのMnPは24時間後にIrgarol 1081を最大37%分解し、P. chrysosporiumのLiPは4時間後にベンタゾンを最大100%分解した。 また、カテコールによるlaccase、酸化還元剤ABTSによるMnP粗抽出物、リコンビナントMnPにより、ベンタゾンが効果的に変換された。 表3にまとめたデータの解析から、MnP、ラッカーゼ、ラッカーゼ-レドックスメディエータ系は、ジケトニトリル、グリホサート、Pesticide Mix 34、クロロクスロン、アトラジン、ダイムロンといった広範囲の除草剤の分解に最も有効なツールであるが、チョロニトロフェンやニトロフェンは例外という結論になった。 ラッカーゼ-レドックスメディエーター系の除草剤に対する効果は、使用するレドックスメディエーターに大きく依存し、さらにメディエーターの酵素による酸化機構や中間体の反応性に依存することが強調された。

参考文献(1954-1954-1954)

Ref.

25℃、pH4.5

Coriolopsis fulvocinerea

PF6.PF6.PF6>

25℃、pH 4.0

pH 3.0

30℃, pH 5, veratryl alcohol + Mn2+ + H2O2

pH 3.5, ベラトリルアルコール+H2O2

pH 3.0, ベラトリルアルコール + Mn2+ + H2O2 + Tween 80

Coriolus versicolor

Phanerochaete chrysosporium

30℃, pH 5, veratryl alcohol + Mn2+ + H2O2

Phanerochaete chrysosporium

Bentazon

の場合。

1963> 19635, Mn2+ + Tween 80

Lac+MnP Bentazon+H2O2

39℃, ベラトリルアルコール+Mn2++H2O2

No

酵素 除草剤 酸化還元剤 反応条件 時間h 消滅率 Fungus
ラッカセイ アトラジン 240 0 Koroleva & Gorbatova (unpublished data)
0 1953 0 1954 1953 0 0
HBT 70
Syringaldezine 0
0.5 100 Polyporus pinsitus
Chloronitrofen No 0 Coriolus versicolor
HBT 0
Diketonitrile (isoxaflutole の派生物) ABTS 0.3-0.4 nmol /(h単位) Trametes versicolor
Dymron No 37°C 24 0 Trametes versicolor
ABTS 60°C 24 >90
HBA 90
MeHBA 90
NNDS >90
グリホサート No pH 6.0, Mn2+ + H2O2 + Tween 80 24 90 Trametes versicolor
No pH 6.0, Mn2+ + Tween 80 90
ニトロフェン No 0 Coriolus versicolor
HBT
Laccase, 固定化 クロロクスロン なし 30℃、pH4.5 0.5 80 Trametes versicolor
3-HAA 0.5 0.5 80
HBT 0.3 100
Syrinaldehyde 0.5 80
LiP Atrazine No 1 0 Phanerochaete chrysosporium
Bentazon No 4 ∼100 Phanerochaete chrysosporium
Chloronitrofen No <6767> 0 Coriolus versicolor
No Phanerochaete chrysosporium
Glyphosate No 24 0 Trametes versicolor
Nitrofen No 0
No 0
MnP Atrazine No 1 0
No pH 4.5, Mn2+ + Tween 80 168 ∼700 Aspergillus oryzae
Chloronitrofen No 0 Coriolus versicolor
Glyphosate No pH 4.5, Mn2+ + H2O2 + Tween 80 24 100 Nematoloma frowardii
No pH 4.1 24 1963> 1963 100
Irgarol 1051 No 30℃, Mn2+ + グルコース + グルコースオキシダーゼ 24 37 Phanerochaete chrysosporium
Nitrophen Nitrophen No 0 Coriolus versicolor
Pesticide Mix 34 No 35°C.を使用。 pH 4.5, Mn2+ + H2O2 + Tween 80 144 20-…100 Nematoloma frowardii
Lac+MnP Bentazon ABTS Mn2+ + H2O2 + Tween 80 Mn2+ + H2O2+ ABTS 24 98 Ganoderma lucidum
LiP+MnP Atrazine No 24 0 Phanerochaete chrysosporium
No 30°C, pH 5, veratryl alcohol + Mn2+ + H2O2 1 0
Diketonitrile (isoxaflutole の派生物) No 30°C, pH 3 or 5, H2O2 12 0 Phanerochaete chrysosporium
1-HBT 0
3-HAA 0
ABTS 0
Diuron pH 3.0, veratryl alcohol + Mn2+ + H2O2 24 0 Phanerochaete chrysosporium

表3.

白色腐朽菌の生産するリグニン分解酵素による除草剤の分解

イルガロール1051-s-トリアジン除草剤の誘導体

1-HBT – 3-ヒドロキシベンゾトリアゾール

HBA – 4-ヒドロキシ安息香酸

MeHBA – メチル-4-ヒドロキシ安息香酸

NNDS – 1-nitroso-2naphtol-3,6-ジスルホン酸

Laccase iimmobilized – Laccase iimmobilized on the electrospun zein polyurethane nanofiber via cross-linking with glutaraldehyde

Coriolopsis fulvocinereaからの精製ラッカーゼとアトラジン分解についての研究において、Coriolopsisは、ラッカーゼとラッカーゼの複合体であることを示した。 除草剤の分解は観察されなかった(Koroleva & Gorbatova, unpublished data)。 レドックスメディエーター(シリンガルデジン、PF6、 , HBT)のスクリーニングにより、ラッカーゼ-アトラジン-レドックスメディエーター系ではHBTのみがアトラジン濃度の減少を引き起こすことが明らかになりました。 モデル系「アトラジン/ラッカーゼ/HBT」の構成要素をさらに詳細に検討した結果,HBT自身はラッカーゼの関与なしにアトラジンおよび他の塩素含有アトラジン誘導体と直接反応し,アトラジンヒドロキシ誘導体とは相互作用しないことが明らかになった。 水溶液中のHBTはイオン状に移行することが知られている。 したがって、アトラジンの(2)位に(-N-O-C-)結合が形成され、HBTとアトラジンからなる2つの生成物を形成することが示唆されている。 HBT/Atrの溶液にラッカーゼを添加すると,いくつかの生成物が形成され,そのうちの1つはHBT-Atr化合物と保持時間が一致した。 酵素反応では,保持時間が15.3分と19.4分の2つの生成物が形成され,これらはdeethylatrazine(DEA)およびDEAとHBTの相互作用により形成される化合物と同定された。 このように,酵素の添加により,HBTとアトラジンの反応で生成するものとは異なる新たな生成物が生成されることが確認された。 モデル系「アトラジン/ラッカーゼ/HBT」を、アトラジン/メディエーターのモル比を変え(9:1~1:9)、酵素濃度を2種類(0.02μmと1.0μm)で検討した。 HBT/Atr比9/1、酵素濃度0.02μmで最も高いアトラジン変換率(10日間で最大70%)が確認された。 プロトン核磁気共鳴(1H-NMR)とHPLC-MS/MSにより、モデル系「Atr/HBT」と「Atr/HBT/laccase」において生成物を確認した。「Atr/HBT」系ではAtr-HBT、「Atr/HBT/laccase」系ではDEAとDEA-HBTが生成していることが確認された。 Atr-HBTはプロトン化(M.W. 315g/mol)とジプロトン化(M.W. 316g/mol)の2つの形態で存在した。 Atr/HBT/laccase “反応では、DEAが生成し、生成物DEA-HBTのプロトン化体(M.W. 287 g/mol)およびジプロトン化体(M.W. 288 g/mol)も生成している。 5つの確立した生成物構造について得られたデータを基に、非酵素的段階と酵素的段階を含む「ラッカーゼ/HBT」システム(図2)によるアトラジン酸化スキームを提案した(図3)

図2.

「Atr/HBT」系におけるアトラジン酸化のスキーム.

図3.

「Atr/HBT/laccase」システムにおけるアトラジン酸化の一般的スキーム。

非酵素的段階において、アトラジンとHBTからなる生成物が形成される。 Atr/HBT」系では基質と生成物が平衡状態にあるため、反応にラッカーゼを加えるとHBTが酸化され、HBTラジカルが生成される。 HBTラジカルはAtr-HBT化合物と反応し、(-NH-CH-)結合の解離を誘発し、DEA-HBTとエチルアルコールが生成される。 次に、DEA-HBTは分解して2つの生成物を形成する。 DEAとHBTである。 HBTは互変異性体を形成し、アトラジンと直接反応することから、HBTは反応混合物中で分解することが示唆された。 しかし、提案したスキームでは、DEA-HBTの加水分解の際に、DEAとHBTが形成された。 このことは、ラッカーゼ-レドックスメディエーター系においてHBTがレドックスメディエーターとして有効である理由の一つと考えられる。

除草剤変換におけるWRFおよびそのリグニン分解酵素の高い可能性は、よく知られているところである。 それにもかかわらず、多くの除草剤の分解機構や分解経路はまだ解明されていない。 WRFやリグニン分解酵素による除草剤の分解機構を解明し,生成する代謝物を同定するためのさらなる研究が必要である