はじめに

試料全体に光が当たるような顕微鏡技術は、「ワイドフィールド」イメージングとして知られています。 ワイドフィールドの対極にあるのが共焦点で、ピンホールを使ってサンプルへの光とサンプルからの光のほとんどを遮断します。 この記事では、広視野イメージングと、顕微鏡で最も広く使われている広視野技術について説明します。

広視野顕微鏡

広視野では、ランプ光源によって試料全体が下から（正立顕微鏡）または上から（倒立顕微鏡）照らされます。 一方、液体に浸かっている試料は底に沈むため、顕微鏡の対物レンズで下から見た方が見やすく、倒立顕微鏡の方がよく使われます。 ライフサイエンス分野で研究される細胞は、通常、付着性（表面に付着して成長する）か懸濁性（液体に浮遊して成長する）のどちらかであるため、懸濁細胞のイメージングが可能になります。 図1：正立顕微鏡と倒立顕微鏡の例

広視野顕微鏡は、一般的に白色光源（ランプなど）を使用しますが、蛍光の場合はいくつかのフィルターで十分です。

広視野顕微鏡技術

広視野顕微鏡技術の例としては、明視野、微分干渉コントラスト（DIC）、位相差、および広視野蛍光が挙げられます。 この方法は試料の準備がほとんど必要なく、生きた細胞を素早く簡単に確認したり、補足データを作成したりするのに利用できる。 しかし、ほとんどの細胞サンプルは透明であり、染色や色素なしでは解像が難しいため、造影剤の使用を強く推奨します。 細胞はほとんど水であり、透明なガラスやプラスチック上でイメージングする場合、何らかのコントラストを追加しなければ、より小さな構造を拾い出すことは困難です。

微分干渉コントラスト（DIC）では、2つの偏光ビームに分割した光でサンプルを照明し、これらのビームが再結合したときに、位相シフトの違いが最終画像のコントラストとして現れます。

位相差顕微鏡は、試料からの散乱光を利用することにより、明視野よりも優れたコントラストを実現します。 試料を光の輪で照らし、顕微鏡のファインダーの前に別の輪を置くことで、光の散乱が異なる部分が画像上で暗くなったり明るくなったりし、通常の明視野顕微鏡よりもコントラストが強くなります。 このコントラストの向上は、厚い試料ではアーチファクトが発生するため見られませんが、細胞培養には効果的です。

広視野蛍光顕微鏡は明視野顕微鏡と似ていますが、特定の波長の光を使用して、サンプルが前処理された蛍光分子を励起します（一部のサンプルは自然に自己蛍光を発しますが）。 試料を特定のタンパク質や細胞成分の蛍光マーカーで染色し、その蛍光マーカーからの蛍光発光光で画像を形成することができる。 蛍光シグナルは、画像全体を照らすのではなく、特定の波長の光を用いて蛍光分子のみを発光させるため、他の手法に比べてコントラストが高いのが特徴です。 しかし、この光で試料全体を照らすため、観察領域外からの蛍光信号が背景蛍光となり、画像がぼやけてしまいます。

焦点外光

最大の欠点は、試料全体に光が当たるため、焦点面が受光して画像を生成できる一方で、焦点面の上下の面にも光が当たってしまい、焦点外光が発生して画像が劣化することです。 特に蛍光励起の場合、背景の蛍光もカメラに取り込まれ、S/N比が低下するため、広視野システムの解像度が制限される。

この問題を回避できるのが、構造化照明顕微鏡（SIM）です。SIMでは、光のパターンを利用して複雑なパターンを生成し、そのパターン干渉に基づくイメージングによって、200 nmという小さな対象物を超解像レベルで解像することができます。 SIM についての詳細は、当社の Web サイトの SIM appnote をご覧ください。

概要

広視野画像は、ほとんどの細胞研究の基礎であり、研究者はサンプルの準備や専門知識があまり必要なく、すばやく簡単にサンプルを画像化することができます。 明視野から蛍光イメージングまで、広視野は多くの研究者が慣れ親しんでいる強力かつ多様な技術です。 共焦点顕微鏡やその他の高度な顕微鏡アプリケーションと比較すると、この技術は解像度に欠けるかもしれませんが、ワイドフィールドイメージングは研究において確固たる地位を築いており、今後も発展し続けるでしょう

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