要旨

2010年から2014年にかけてポーランドの異なる地域から野鳥474羽、馬378頭、髄膜炎およびリンパ球性髄膜炎のヒト42人の血清試料が採取された。 ウエストナイルウイルス（WNV）抗体は、競合型酵素結合免疫吸着法を用いて検出した。 ELISA-1 ID Screen West Nile Competition, IDvet, ELISA-2 ID Screen West Nile IgM Capture, ELISA-3 Ingezim West Nile Compac.を使用した。 野鳥血清474検体中63検体（13.29％）、馬血清378検体中1検体（0.26％）で抗体が検出された。 患者血清42例のうち14例（33.33％）がWNV抗原に対して陽性であり，1例が疑陽性であった． 鳥で得られた陽性検体は，次にウイルス微量中和試験で再検査し，陽性結果および日本脳炎複合体の他の抗原との交差反応を確認した． 我々は，ヒト，鳥および馬の血清学的陽性結果は，WNVがポーランドの生態系と何らかの密接な関係があることを示していると考えている

1. はじめに

ウエストナイルウイルス（WNV）は、幅広い種類の鳥類、馬、およびヒトに感染する可能性がある。 このウイルスは、世界中のこれらの動物やヒトの疾病の原因となる新興の病原体である。 WNV の主な媒介者は吸血昆虫の数種で、鳥、馬、および人間にウイルスを感染させます。

感染は、これまで動物にのみ病原性が認められていた要因による高い発熱、麻痺、病的状態によって特徴づけられます。 より多くの場合、感染は軽度の臨床症状によって特徴付けられる.

WNVは、通知義務の下で病気を引き起こす神経栄養因子として、動物保健世界機構（OIE）のリストに載っている。 このウイルスによるウエストナイル熱（WNF）は人獣共通感染症であり、米国では大きな公衆衛生問題となっています。

WNVは、フラビウイルス科フラビウイルス属に属するアルボウイルスで、日本脳炎ウイルス（JEV）、セントルイス脳炎ウイルス（SLEV）、マレーバレー脳炎ウイルス（MVEV）、ウスツウイルス（USUV）と抗原的に関連し日本脳炎抗原複合体に含まれています。 このウイルスのssRNA+ゲノムには、11.000から12.000ヌクレオチドまでの単一のオープンリーディングフレームが含まれています。 ウイルスゲノムは、NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5の7つの非構造タンパク質と、糖タンパク質E、コアタンパク質C、膜前タンパク質prMの3つの構造タンパク質から構成されています。 WNVの1系統は世界中で分離されている系統であるが，2系統はアフリカとマダガスカルでのみ分離されており，2004年にアフリカからの渡り鳥によってハンガリーに持ち込まれた新しい2系統によるWNVが発生するまで，この系統はハンガリーで発生していた． 同じ系統の2型が2010年夏にギリシャでヒトの風土病である神経侵入性疾患（WNND）を引き起こし、262人の患者が確認され、35人が死亡した。 2011年には、このウイルスはギリシャの中央部にも広がりましたが、患者数は減少し、101人が診断され、9人が死亡しました。 ギリシャにおけるウイルス感染者の総数は、18000人と推定されています。

300種類以上の鳥類がWNVに感染しています。 通常、ウイルスは野鳥と蚊の間で閉じたサイクルで循環し、鳥が各地に移動する際に運ばれます。

ウイルスは世界中の多くの国で発生し、ポーランドに隣接する国々を含むヨーロッパの20カ国でも存在が確認されました。 また、ポーランドの野鳥とヒトの血清サンプルでWNV抗体の存在が確認されました。

2010年には、ギリシャ、ロシア、ルーマニア、イタリア、イスラエルで、WNV感染によるヒトの罹患と死亡が報告されました。 ポーランドでもウツ病のウイルスの循環が確認されています。

研究の目的は、さまざまな野鳥、馬、および神経症状を持つ入院患者の血清サンプルにおけるWNV抗体の検出である

2. 材料と方法

鳥類. 474羽の野鳥の血清サンプル、400羽のコウノトリ（Ciconia ciconia）、21羽のキジ（Phasianus colchicus）、19羽のチャフキン（Fringilla coelebs）、9羽の野鴨（Anas platyrhynchos）, オジロワシ（Haliaeetus albicilla）4羽、ニシキテグリ（Tetrao urogallus）2羽、旅客ハト（Ectopistes migratorius）6羽、キタオオタカ（Accipiter gentilis）3羽。 ポーランド国内の異なる場所（動物園、保護動物リハビリテーションセンター）で、ヒクイドリ（Corvus cornix）2羽、オオタカ（Accipiter gentilis）3羽、ツバメ（Apus apus）、ツグミ（Turdus merula）、ムクドリ（Sturnus vulgaris）、カラス（Corvus corax）、ノスリ（Buteo buteo）1羽が採取された。 しかし、ほとんどのサンプルはアルバトロス財団の野鳥リハビリテーション・センターで採取されたものである。 サンプルは、蚊の活動が最も活発だった2010年から2014年の3月から10月の間に収集された（図1）。

馬。 4つの地域にあるいくつかの牧場から健康な飼い馬の血清378検体を採取した。 また、競走馬の血清も採取した（図1）。

ヒト。 ビアリストク医科大学感染症・神経感染症科の患者42名（男性17名、女性25名）由来の血清試料。 患者は髄膜炎，リンパ球性髄膜炎，ダニ媒介性脳炎に特徴的な神経学的症状を呈していた。 彼らは2010年5月から9月の間に入院していた。 すべての患者を，Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemensでダニ媒介性脳炎ウイルス抗体検査を行った． サンプルは-20℃で保存した。

検査したすべてのサンプルは、バイオセーフティレベル3+の条件下でダブルチェックし、検査を実施した。

エリサ-1. 日本脳炎ウイルスと共通のエピトープを含むpr-Eおよびpr-Mエンベロープタンパク質に対するウエストナイルウイルス抗体の検出のために、市販の競合品であるELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, France) を用いて、メーカーのプロトコルに従って血清学的研究を実施した。 すべてのサンプルは2回検査した。 マイクロプレートは450 nmで読み取った。 ELISAは残留結合率（S/N%）を算出することで検証した。 S/N比が40％以下の血清試料を陽性とし、50％以上の試料を陰性とした。 8088>

ELISA-2 は ID Screen West Nile IgM Capture (Innovative Diagnostics, Montpelier, France) を用いて実施した． ウェルにはIgMポリクローナル抗体を塗布した。 陽性の場合、抗体の存在は青色の溶液として現れ、停止液の添加後は黄色になった。 抗体非存在下では、発色は見られませんでした。 ELISA-3は、WNVのprotein Eに特異的なモノクローナル抗体（MAb）を用いたブロッキングELISAに基づくIngezim WNV Compac enzymatic assay（Ingenasa, Spain）を用いて実施した。 血清試料中に抗体が存在する場合は、抗原と結合した。 プロテインEに特異的なMAbを添加すると、血清試料中の抗体によってブロックされない抗原に結合した。 抗原をブロックする抗体がある場合、コンジュゲートは結合しなかった。 測定は、基質添加後の比色反応により読み取った。 OD 値が陽性対照血清試料と同等かそれ以下の場合、陽性とした。 OD 値が陰性カットオフ値以上であれば陰性とした。 OD値が両者の範囲にある試料は疑陽性とした。

ウイルス中和試験 野鳥のELISA陽性試料を用いたウイルス微量中和試験を、欧州基準研究所、ANSES、フランスで実施した。 試験にはVero細胞とWest Nile virus, strain IS-98-ST1が使用された。 検査はOIEの標準手順に基づいて行われた。 結果

ポーランドの地区と検体が採取された地域を図1に示す。

ほとんどの検体は、譲渡と獣医治療中の鳥から採取された。 いくつかの鳥は、いくつかの事故の後、リハビリテーションセンターにいた。 鳥は、神経疾患の症状や神経感染の兆候を示さなかった。

血清検体の検査では，野鳥63検体（コウノトリ62，チャバネ1）からWNVの特異的抗体が検出された． ヒト血清では42例中14例が陽性，1例が疑陽性であった． 患者は全員，蚊やダニに刺された既往があった． この結果を確認するため，免疫反応の第一段階として血清中のWNV IgM特異抗体を検出するELISA-2を実施したところ，16名がダニ媒介性脳炎と診断された． 結果は陰性であったため、IgM抗体の存在や動物の最近の感染の証拠は確認できなかった。

ELISA-1で得られた結果を確認するために、ELISA-3を行い、これらの症例でWNV特異的抗体の存在が確認された。 その結果を表1に示す。

For confirmation of positive results, birds’ positive serum samples were retested by virus microneutralisation test.TM.

異なる診断方法（ELISAおよびウイルス中和試験）で得られた結果の比較を表1に示す。 議論

過去数年間、WNVが穏やかな気候の国で広がっていることが指摘されている。蚊科の蚊はウイルス拡散の最も一般的なベクターで、今日では6種の蚊がポーランド気候帯に存在している。 前世紀90年代にJuřicováらは、ポーランドのカンピナス森林地帯において、家スズメ（Passer domesticus）の12.1％とユーラシアスズメ（Passer montanus）の2.8％にWNV抗体を血球凝集阻害法を用いて確認している。 その後、ポーランドの他の地域でもコウノトリ3羽、カラス1羽、コハクチョウ1羽でWNV抗体が検出された。

得られた結果を提示し、確認するために3種類のELISAを実施した。 最初のELISAはID Screen West Nile Competitionで、WNVに特異的な検査であるが、JECVのメンバー間の血清学的交差反応も得られる。 陽性の結果が得られた場合、WNVのみに特異的で交差反応を除くことができるがIgMのみを検出するELISA-2 West Nile IgM Capture試験を行った。 つまり、最近の感染のみを特定でき、IgG抗体は検出できない。 ELISA-1によって得られた結果を確認するためにELISA-3を用いたところ、100％の症例で確認された。

本研究では、ELISAによって得られた野鳥の血清試料による陽性結果は、ウイルス微量中和試験で確認された。 さらに，髄膜炎，リンパ球性髄膜炎，ダニ媒介性脳炎の症状を有する患者の血清検体42例中14例でELISA法によりWNV抗体が検出されたが，得られた結果をplate reduction neutralisation test（PRNT）により確認することができなかった． ヒトのWNV感染と脳脊髄液中のWNVの同定は，通常，RT-PCR，Nested PCR，あるいはホルマリン固定パラフィン包埋ヒト組織ではRT-PCRで確認されている． Czuprynaらの研究によると，ビアリストク医科大学感染症・神経感染症科に入院した24人の患者の脳脊髄液は，すべてWNV RNA陰性であった。

ヒト，鳥，馬の血清は，WNV特異抗体を測定するのに適した試料として使用された。 血清サンプルで特異的な抗体を確認した場合、その動物またはヒトは（ポーランド国内または国外において）ウイルスに接触したと見なされた。 陽性の野鳥は、国外でウイルスに接触している可能性があると考えられる。 ヒトの陽性例では、11名がポーランドから出国していないので、すでにポーランドでウイルスと接触していたことになる。

欧州の疫学的状況、WNV感染における野鳥の役割、およびヒトと鳥の血清学的検査の結果から、ポーランドにWNVが存在する可能性があることがわかった。 ポーランドでは，Swietokrzyskie (28.85%) と Podlaskie (34.14%) の地域の発熱女性および健康な森林労働者からWNV抗体が検出された． この血清学的結果は、ウイルスが我々の気候帯と生態系にすでに存在していることを示唆するものである。 また、ダニ媒介性脳炎や風土病のウイルスとの交差反応の可能性を考慮する必要があります。

倫理的承認

本研究は、ルブリンのII地方倫理委員会（2010年11月16日の番号92/2010）の承認を受け、環境保護総局長の許可（番号DOP-OZGŁZ. 6401.03.36.2011.dł）

利益相反

著者は利益の衝突がないことを宣言する。

謝辞

著者らは、フレームワークプロジェクトP/020「ウイルス疾患の拡大時のリザーバーおよびベクターとしての自由生活水鳥」およびフレームワークプロジェクトW/211「ポーランドにおける鳥類の西ナイルウイルス感染発生の診断方法とリスク評価（2014～2018）」による財政支援に感謝したい

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