• By Sara Ryding, B.Sc.Reviewed by Deepthi Sathyajith, M.Pharm.（Deepthi Sathyajith, M.Pharm.（Deepthi Sathyajith, M.Pharm.）.

  Whole genome bisulfite sequencing（WGBS）は、DNAメチル化を解析するための次世代シーケンサー技術である。

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  DNA メチル化は遺伝子発現を制御するエピジェネティックなメカニズムであり、シトシン塩基にメチル基を付加することが関与しています。 メチル化パターンの異常は、癌などのいくつかの症状や疾患と関連している。 WGBSの開発以来、エピジェネティック・リプログラミング、エピジェネティック・シグネチャーなどの研究に応用されています。

  基本的な方法

  WGBSは、二硫酸ナトリウム処理とハイスループットDNAシーケンスの使用を組み合わせたものです。 重亜硫酸ナトリウムはメチル化されたシトシン、すなわちメチルシトシンを変換から保護し、一方、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換される。

  メチル化されていないシトシンは、PCRを経てさらにチミンに変換される。つまり、配列決定の結果は、アデニン、グアニン、チミンが主で、シトシンがあればメチル化シトシン部位を示すことになる。 その後、試行されたすべてのシトシンの約90%を分析できることが証明された。

  幹細胞への応用

  幹細胞は、神経細胞や筋肉細胞など、あらゆる種類の細胞になる能力を保持している未分化な細胞である。

  ヒト胚性幹細胞と胎児線維芽細胞におけるメチル化シトシンの初のゲノムワイド1塩基分解能マップは、両者に大きな違いがあることを示しました。 胚細胞では、確認されたすべてのメチル化のほぼ4分の1が非シトシンのグアニン（CG）コンテキストにあったのに対し、胎児細胞ではメチルシトシンの99.98％がGCコンテキストにあった。

  非CGコンテキストとはCHGまたはCHH（Hはアデニン、チミン、シトシンのいずれか）にあったことを意味する。 それ以前は、哺乳類のDNAのメチル化はほとんどすべてCG文脈で起こると考えられていたが、この研究では、ヒト胚性幹細胞では一般的な特徴である可能性が示された。 胎児細胞を人工多能性幹細胞に操作すると、非CGメチル化が回復した。 また、CHGやCHHのメチル化は遺伝子の違いによるものではなく、胚性幹細胞の特徴であることが示された。

  これまでの研究で、幹細胞は人工多能性幹細胞でも胚性幹細胞でも、メチル化によってエピジェネティックな特徴を共有していることが示された。 幹細胞は、治療目的や病気の研究において非常に重要である。

  その後の研究では、胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の違いに着目し、そのメチル化パターンは世界レベルで非常に似ているものの、人工多能性幹細胞は胚性幹細胞に比べて再プログラムにかなりのバリエーションを示すことを発見しました。 このように、WGBSは幹細胞に関する多くのことを解明してきましたが、まだいくつかの疑問が残っています。

  発生生物学におけるWGBS

  DNA メチル化は哺乳類の正常発生において重要です。 特に、多能性幹細胞や卵母細胞では非CGメチル化が広く見られます。

  研究者はWGBSを用いてこの概念をさらに探求し、マウス胚珠卵母細胞における全メチル化のほぼ2/3が非CGコンテキストで起こっていることを発見しました。 また、非CG部位のメチル化は卵子の成長過程で蓄積することも明らかにした。

  非CGメチル化は特に少数のメチル化酵素、すなわちDNAメチル化酵素複合体、すなわちDnmt3s-Dnmt3L複合体に依存しているようであった。 一方、Dnmt1はCGメチル化を維持するようであった。

  エピジェネティックプログラミングの継承は哺乳類よりも植物で一般的である。 メチル化に着目した研究では、WGBSを用いることで、植物の生殖細胞はCGとCHGのメチル化を維持することを発見した。 これは、哺乳類では小胞子や精子細胞でCHHメチル化が失われているのとは対照的である。

  病気の早期診断に役立つWGBS

  急性前骨髄球性白血病や胃がんなどの癌で見られる、特定のメチル化過剰の抑制遺伝子をスクリーニングして、異常メチル化の検出に利用できることが示されました。

  Applications of WGBS in Forensic Science

  DNA抽出後の乾燥血液スポットサンプルに対してWGBSを用いた法医学的研究が行われています。 WGBSの使用により、法医学的染色体のDNAメチル化解析を向上させる高品質のサンプルが得られます。

  要約すると、WGBSは、バイサルファイト変換したゲノムDNAのDNAメチル化を1塩基分解能で推定できることから、DNAメチル化の研究においてますます人気が高まってきているということです。

  WGBSはエピジェネティック・リプログラミングを理解するための非常に有効なツールですが、科学研究の様々な分野で使用できる費用対効果の高いハイシーケンス技術を開発し維持することも同様に重要な課題となっています。

  Source

  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29668744
  • https://www.nature.com/articles/nature08514
  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3521964/
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  • https://academic.oup.com/bib/advance-article/doi/10.1093/bib/bbx077/4002722#93531627

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