Abstract

ヒト胚性幹細胞（hESC）は、さまざまな変性疾患の治療に大きな可能性を持っている。 多能性を持つhESCは、培養中に無制限に自己複製を行い、体内のあらゆる細胞型に分化する素晴らしい能力を持つ。 しかし、hESC研究の道のりは決して平坦ではなく、腫瘍形成や免疫拒絶だけでなく、社会的、倫理的、政治的な面でもいくつかの難題に直面しています。 ヒト胚からhESCを分離することは、ヒト胚の破壊を必要とするため、非常に好ましくないこととされています。 この問題は、公的機関や政府のプラットフォームで議論され、世界中の多くの国でhESC研究が禁止されるに至りました。 この禁止措置により、世界中の多くの連邦政府が研究資金を停止し、hESC研究の進展に悪影響を及ぼしました。 その後、一部の国では禁止措置が解除され、hESC研究への資金提供が可能となったが、研究の進展にはすでにダメージが及んでいる。 このような不利な状況下でも、様々な戦略を用いてhESCの分離、培養、特性解析に一定の進展がみられた。 このレビューでは、hESCの分離、培養、特性解析に成功した様々な戦略についてまとめています。 最後に、hESCは、テラトーマ形成や免疫拒絶反応を最小限に抑える適切な戦略や、より良い細胞移植戦略によって、臨床応用に大きな可能性を秘めています。 胚性幹細胞（Embryonic Stem Cells）。 胚性幹細胞は1981年にマウスの胚から初めて分離され、「胚性幹細胞」という言葉はGail R. Martinによって初めて造語されました。 しかし、1998年にトムソン博士のチームが、ヒトの胚からヒト幹細胞を分離する技術を初めて示したことで、ESCの存在が世界中に知られるようになった。 その後、研究者たちは、hESCがランゲルハンス島のベータ細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞様細胞など、あらゆる体の細胞に分化する能力を持つことを実証してきた。 hESCの多能性能力は、糖尿病、パーキンソン病、心血管疾患、肝疾患に苦しむ何百万人もの患者に希望を与えています。 このようにhESCには大きな治療的可能性があることから、世界中で数種類のhESCが作製されています。 hESCはヒト胚の内部細胞塊（ICM）からしか得られないため、ヒト胚から幹細胞を分離する方法が課題となっていました。 研究者たちは、ICMは新鮮なヒト胚からも凍結したヒト胚からも得ることができると報告しています。 その後、1つのヒト胚からICMを分離する方法がいくつか開発されました。その中には、機械的な圧力でICMを分離するメカニカルディセクションが含まれます。 また、レーザーによる剥離や免疫外科的手法によってもICMを単離することができる。 ICMを分離するために免疫手術を用いることには様々な利点があるが、同時にいくつかの欠点もある。 例えば、モルモットの血清を含む培地が必要であり、動物の血清を使用するため、臨床グレードのhESC株の作製には適さない。 別の方法として、ヒト胚盤胞を細い針でマイクロダイセクションすることにより、ICMからhESC株を単離することができる。 レーザー支援生検もまた、キセノンフリーでICMを分離するための最も有望な技術です。 ICM分離後、フィーダー層、細胞外マトリックス、タンパク質、ペプチド、合成高分子を用いて幹細胞を増殖させ、ESCsを生成する。 ICM単離の様々な方法の利点と欠点を表1にまとめた。

ICMの分離にはヒト胚の破壊が必要であり、これは深刻な倫理的問題を提起しています。 この倫理的な問題を解決するために、研究者たちは、ヒト胚を殺したり破壊したりすることなく、単一の胚盤胞からヒトESCを分離する別のアプローチを実証した。 例えば、着床前遺伝子検査の際に、患者から単一の胚盤胞を持つ胚の生検を行うことができる（；Klimanskaya et al.） 1つの胚盤胞生検から5つのhESC株を得ることに成功したことが報告されている。 良質なhESCを得ることができるかどうかは、胚盤胞の質、分離手順、培養条件によって異なる。 4個の胚盤胞から2個のhESC株が得られたが、13個の胚盤胞からは3個のhESC株しか分離できず、場合によっては58個の胚盤胞から3個のhESC株しか分離できなかったと報告されている . このような胚盤胞からの hESC 株分離の違いは、主に胚の質に起因し、また胚の分離方法と培養プロトコールに依存するものである . 例えば、体外受精で得られた胚の場合、接合後染色体異常の発生率が高く、最終的に質の悪いhESCが得られる可能性が高い。

マウスでは、着床後の胚の上胚葉からも多能性幹細胞が得られ、一般に上胚葉幹細胞として知られている。 これらの多能性幹細胞はプライム化された性質を持ち、自己複製にはFGFやアクチビンのシグナル伝達経路の活性化が強く関与している。 そのため、マウスではナイーブ、プライム、グランドという3つの異なる多能性状態が定義されている。 フィーダー細胞の有無によるhESCの培養

芽球を採取すると、通常はフィブロネクチンとラミニンを含む培地で親生検胚と共培養される。 ラミニンの添加は、胚性幹細胞（ESC）様の凝集体を形成するために重要である。 また、無血清培地や線維芽細胞増殖因子の添加により、幹細胞の増殖が促進され、胚性幹細胞の分化が阻害されることを示唆する報告もある . このように、hESCの作製の質と量を向上させるために用いられている様々な培養条件について簡単に説明しました。 マウスフィーダー細胞

マウス胚性線維芽細胞（MEF）またはマウスフィーダー細胞は、hESCの増殖と拡大に適した条件を提供するため、hESCにとって最も重要な要素と考えられています（図1）。 MEFはhESC株の作製に非常に重要であることが報告されています。 さらに、すべての初期のhESC株は、MEF細胞から分泌される成長因子やサイトカインを含む培地で培養されており、これらの成長因子やサイトカインは幹細胞の多能性を維持するために必要である。 MEFはマウス由来であるため、hESCには倫理的あるいは健康上の重大な問題があった。 また、動物由来の細胞を使用することで、動物由来の感染性病原体がhESCに感染し、ヒトでの利用に適さなくなる可能性があります。 MEF細胞は、培養中にhESCに感染する可能性のあるウイルス粒子を含んでいることが報告されています 。 さらに、ウシ血清を使用してhESCを培養している研究者もいますが、動物由来の血清を使用すると、胚性幹細胞培養中にプリオンや動物性ウイルスが感染する可能性があります . 動物由来の細胞や血清は、体外培養中の細胞間相互作用により、ウイルスやその他の病原体を胚性幹細胞に感染させることが報告されています 。 さらに、これらの病原性分子は、胚性幹細胞の培養全体を汚染する可能性がある。 このような病原体でhESCが汚染された場合、その後、非動物性の培養条件にhESCを移植しても、汚染の問題が続く可能性があります。 マウスのフィーダー細胞や動物由来の血清/タンパク質のもう一つの問題は、それらにも非ヒト型シアル酸（Neu5GC）が含まれていることで、これもhESCに深刻な汚染問題を引き起こす可能性がある。 例えば、動物由来のシアル酸が代謝的にhESCの細胞表面に入り込み、胚性幹細胞を汚染することが報告されています。

2.2. hESCを育てる非動物性フィーダー細胞

動物由来の製品や種を超えた汚染を避けるために、研究者は動物成分を含まず、同時に胚性幹細胞の成長と拡大をサポートする培養液を開発しました。 例えば、ヒト卵管細胞、胎児包皮、胎児筋肉や皮膚、遺伝子組み換え胎児肝間質細胞、骨髄、臍帯、胎盤細胞、子宮内膜細胞などが幹細胞の培養や拡張をサポートすることが報告されている。 これらのヒト細胞のうち、ヒト臍帯間質細胞は非侵襲的な方法で採取できる優れたフィーダー細胞源であるが、包皮、胎児、骨髄由来のフィーダー層の使用は倫理的な問題を含んでいる。 最近、市販のヒト包皮線維芽細胞株を用いて、いくつかのhESC株が誘導・増殖された。 子宮内膜細胞もまた、幹細胞のin vitro培養に効果的であることが証明されました . 動物性病原体の混入リスクを排除するもう一つの方法は、ヒト幹細胞株から得られたフィーダー層を使用することである . 塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）は、hESC培養に用いられるヒトフィーダー細胞によって内因的に産生されることが示されている（；Liuら、2014）。 また、これらのフィーダー細胞は、ICMの多能性維持に関与するTGFβやアクチビンAを分泌している . フィーダー細胞依存性HESC培養は、様々な利点があるにもかかわらず、多くの制限がある。例えば、フィーダー層の維持は手間がかかり、フィーダー細胞集団のばらつきが大きすぎる。 この格差は、ヒトへの応用を目指すhESCのクレームにマイナスの影響を与える可能性がある

2.3. hESCを成長させるためのフィーダーフリー培養

動物とヒトの両方のフィーダー細胞には限界があるため、研究者はhESCを培養するために化学的に定義された培養液を探索し、設計することに成功したのですが、その定義済み培地の最も優れた点は、フィーダー細胞を含まないということでした。 フィーダーフリー培地として最初に試みられたアプローチの一つは、幹細胞の増殖と再生のための体外培養条件を作り出すために、細胞外マトリックスタンパク質と成長因子を用いることであった（図2）。 これらのタンパク質のうち、Matrigelは主に成長因子や調整培地と組み合わせてhESCの培養に使用されていました。 しかし、Matrigelは様々な利点がある一方で、その組成に多くのバリエーションがあり、hESCの培養に問題があることが分かっています。 また、Matrigelの使用は、一本鎖マウスRNAウイルス-乳酸脱水素酵素上昇ウイルスに汚染されたMatrigelのいくつかのバッチが報告されているように、臨床的な問題を提起している。 Matrigelの他に、Fibronectin、Laminin、Collagen type IVもゼノフリーhESC培養の良い候補であり、細胞は20継代まで成長することができます。 また、ヒト胎盤由来の ICM を用いて hESC を培養したところ、40 継代まで遺伝的に安定であったという報告もあります。 さらに、ゼノンフリー培地でも80継代まで培養できた。

間違いなく、タンパク質とともに化学的に定義された培地を使用することで、hESCの培養が大幅に改善されました。 さらに、さまざまなタンパク質および組み換えタンパク質も、ゼノフリー条件下での hESC 培養を強化するために使用されました。 E-カドヘリン、E-カドヘリン/ラミニン521、キナーゼ阻害剤、そしてbFGFは、無菌状態で幹細胞を強力に増殖させることが知られているものである。 例えば、ビトロネクチンと結合した合成アクリレート表面であるCorning Synthemax Surfaceは、hESCコロニーだけでなく幹細胞の拡張も促進することが示された（Kawase et al. Wuらは最近、hESC培養を刺激するのに適した基材として、クモの糸タンパク質から分離した新規合成材料の使用について説明した（Wu et al.、2014）。 数多くのポリマーベースの合成表面も、hESC株の成長および拡大をサポートすることが報告されている（Melkoumianら、2010；Brafmanら、2010；Villa-Diazetら、2013）。 hESC の培養を促進するために使用されるさまざまな化学物質のリストを表 2 に示す。

3. hESCの多系統化能

hESCの最大の特徴の一つは、外胚葉、中胚葉、内胚葉の3系統全てに分化することである（図3）。 hESCは多能性幹細胞であるため、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、筋肉細胞など、あらゆる種類の体細胞に分化するユニークな能力を有している。 hESCはまず、基本的に3つの生殖層で構成される胚様体を形成することが報告されています。 この胚様体は、3次元培養で増殖した多能性hESCが、3つの生殖層すべての遺伝子マーカーを発現して形成されます。 多能性hESCは、副腎細胞やケラチノサイト、インスリン産生細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、小島様器官に分化する驚異的な能力を持っています（表3）。 レチノイン酸や神経成長因子などの特定の成長因子は、hESCを機能的な神経細胞に分化させるために使用されています。 さらに、心筋細胞、肝細胞、骨格筋、膵臓細胞、腎臓細胞への分化のために、いくつかの系統特異的な成長因子が使用されています。 これらの分化した細胞は、in vitroおよびin vivoの両方の条件下で、その機能性を調べるための試験も行われています。 hESCのこのような多分化能は、さまざまな変性疾患を治療するための細胞ベース療法に不可欠であることが証明されています。 hESCから様々な種類の細胞を分化させることは容易ですが、治療用に分化させた成熟細胞を大量に得ることは困難です。 分化した細胞を大きく、成熟させ、機能させるためには、培養液に系統特異的な成長因子を含ませることが必要です。 また、細胞移植に必要な細胞は、hESCから大量に作り出すことが重要であり、これはhESCと分化した細胞をバイオリアクターで制御しながら培養することで達成できる。

4. In VitroおよびIn Vivoモデルを用いたhESCのテスト

hESC から様々な細胞型への分化が成功したら、次の論理的ステップは、分化した細胞が何らかの機能性を持っているかどうか調べることである。 幹細胞や分化した前駆細胞や成熟細胞の機能性については、in vitroとin vivoの両方の条件下で広範囲に検討された。 分化した神経細胞、心筋細胞、肝細胞、およびその他の種類の細胞の機能性が、さまざまな動物モデルでテストされた。 パーキンソン病の動物モデルに神経細胞を移植すると、その機能が部分的に回復することがわかった。 また、心血管疾患、脳卒中、糖尿病、脊髄損傷の動物モデルにおいて、hESCとその分化した細胞の移植が試験されました。 動物の中でも、ラットやマウスなどの小型げっ歯類は、細胞移植の研究に適した動物種である。 さらに、小型のげっ歯類は、簡単にアクセスでき、外科的および遺伝学的に容易に操作することができる。 小動物の様々な利点にもかかわらず、多くのマウスやラットのモデルはヒトの疾患表現型を表していないため、マウスやラットの実験が幹細胞を用いた治療の有効性を予測できるかどうかについては、依然として議論の余地がある。 この問題を克服するために、研究者たちは、人間の解剖学や生理学に近い大型の動物に取り組み始めている。 大動物の中でも、イヌ、ヤギ、ヒツジ、霊長類は、マウスやラットよりも幹細胞実験に適したモデルであると考えられている。 大動物を使用する主な利点の1つは、寿命が長く、多くの解剖学的、生理学的パラメータがヒトに近いということです。 これらの動物モデルは、幹細胞が宿主組織に効果的に導入されることを実証しているが、機能的、行動的な完全な回復はまだ達成されていない。 ヒトの疾患に近い動物モデルを開発するために、さらなる研究が必要である。

このようにhESC研究は進歩しているが、hESCを用いた細胞治療の重要な課題の一つは、レシピエントによるhESC由来の細胞の同種免疫拒絶反応である。 移植された幹細胞は、動物で生じた強い宿主免疫反応により、1週間以内にすべて死滅することが判明している。 そこで、幹細胞移植によって引き起こされる免疫反応を抑制する免疫抑制剤を動物に投与し、幹細胞の死滅を食い止めることに成功した。 ところが驚いたことに、動物に免疫抑制剤やタクロリムス、シロリムスなどの薬剤を投与すると、幹細胞は28日間しか生存できず、それ以降は死滅し始めたのだ。 その理由は不明ですが、細胞間の相互作用が理解されていないことが原因の1つかもしれません。 hESCsや分化した細胞を動物実験する前に、in vitroの条件下で試験することが重要です。 動物実験では困難な細胞間相互作用、細胞移動、細胞統合などを、in vitroモデルで詳細に調べることができます。 この問題は、近年の技術革新により、患者固有の体細胞を特定の因子で核再プログラムすることで人工多能性幹細胞（iPSC）を作製し、細胞治療のための再生可能な自己細胞源とすることで緩和される可能性がある。 ヒトの細胞治療におけるiPSCの重要な利点の一つは、患者特異的なiPSCは自己由来であり、したがって、そこから得られた細胞は免疫拒絶反応の心配なく同じ患者に移植できると考えられてきたことである。 しかし、最近の研究で、iPS細胞のエピジェネティクス、ゲノム安定性、免疫原性の異常が明らかになり、iPS細胞を用いた治療に対する安全性の懸念が高まっています

5. hESCの治療応用

hESCは変性疾患を患う患者にとって多くの可能性を秘めているため、ヒトでの治療可能性を探る様々な試みがなされてきた。 幹細胞を用いた治療の主な目的は、失われたり損傷を受けたりした体の細胞や組織を回復または修復することです。 hESCを臨床応用するためには、米国食品医薬品局（USFDA）、現在の優良製造基準（cGMP）、幹細胞の臨床移植のためのガイドラインにそれぞれ従って製造する必要があります。 幹細胞培養に使用される化学物質、試薬、細胞、機械や器具は、安全性と衛生面のチェックを受けなければならず、すべての製造工程はcGMPガイドラインに従って監視され文書化されなければなりません。 現在使用されている多くのhESC株がcGMPガイドラインに準拠しているかを分析すると、多くのhESC株がcGMPガイドラインを満たさないことがわかります。これは、多くのhESCがその分離および増殖の段階で免疫原性または病原性の動物成分に暴露されているためです。 cGMPガイドラインに適合しないもう一つの理由は、hESCの培養作業のほとんどが大学の研究室で行われており、これらの研究室の多くがcGMPガイドラインを遵守していないためです。 今日まで、cGMPガイドラインに従ってhESC株を生産できる研究者はごくわずかです。

hESCの潜在的な商業的利益を考慮し、いくつかのバイオテクノロジー企業も幹細胞製品の商業化を唯一の目的として、幹細胞研究への資金提供に関与しています。 これらの企業は、cGMP条件下でhESCの製造を開始し、臨床環境下で幹細胞のテストを開始した。 2009年、ジェロン社（カリフォルニア州のバイオテクノロジー企業）は、hESC由来の細胞を用いた初の臨床試験を開始することをFDAに申請した。 2010年10月に臨床試験を開始し、脊髄損傷患者3名にhESC由来のオリゴデンドロサイト前駆体細胞150万個を投与しています。 その理由は、試験の予備的な結果、hESCs由来の細胞は脊髄損傷の顕著な改善をもたらさないことが判明したためと思われます。 さらに、FDAは、黄斑変性症へのhESCの使用に関する別の試験も承認している 。 また、マサチューセッツ州マールボロにあるアドバンスト・セル・テクノロジー社は、hESCを使った臨床試験を開始した。 スターガート筋ジストロフィーや加齢黄斑変性症の患者を対象に、細胞を注射して治療した。 使用したのは、hESC由来の網膜色素上皮（RPE）細胞。 この研究では、RPE細胞を患者に投与し、移植後4カ月経過した時点で、免疫拒絶反応やテラトーマ形成の兆候を示すことなく、患者にわずかな視機能の改善が見られることが判明した。 また、I型糖尿病の患者さんに膵臓前駆細胞を投与して、幹細胞をテストしました。 まとめと結論

ヒト胚性幹細胞は、がん、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病などさまざまな病気の治療に大きな可能性を持っています。 in vitroとin vivoの両方の研究により、将来の胚性幹細胞が様々な病気の治療法となる希望が残されていることが示唆されている。 しかし、幹細胞を用いた治療が成功するかどうかは、成熟した機能的な細胞が利用できるかどうかにかかっている。 成熟した機能的な細胞を得るためには、幹細胞を3次元培養条件下で培養することが望ましい。 ほとんどのhESC株は、2次元（2D）培養条件下で得られている。 2次元培養の限界として、2次元培養のhESCは人体の細胞ではないこと、2次元培養のhESCの多くは細胞移植後すぐに死んでしまい、生き残った細胞も体組織の修復に失敗することが報告されています。 この問題は、細胞が3方向に増殖する3次元培養を行うことで、細胞移植後の生存率を高めることができます。 幹細胞を用いた治療を成功させるために考慮すべきもう一つの重要な点は、ヒトで実験する前に、動物モデルで幹細胞由来の細胞を厳密に評価することである。 細胞間の統合、細胞間のコミュニケーショ ン、細胞移動、細胞の機能性などを、短期および長期の試行アプロ ーチを用いて、動物モデルで徹底的に評価する必要がある。 また、外傷形成や免疫拒絶に関する問題は、免疫拒絶を起こさず、移植後に腫瘍を形成しない幹細胞株を開発することで解決しなければならない。 これは、腫瘍形成や免疫拒絶の引き金となる遺伝子・分子経路をそれぞれサイレンシングすることで実現できる。 さらに、細胞を用いた治療には多くの成熟細胞が必要であり、新しい革新的なアプローチや方法論によって、大量の幹細胞やその前駆細胞を分離することにも力を注ぐべきである。 最後に、ヒト胚性幹細胞は、様々な変性疾患の治療や診断への応用に大きな可能性を持っている。

謝辞

著者らは、サウジアラビア王国ダンマームのImam Abdulrahman Bin Faisal University, Research and Medical Consultations（IMRC）の全マネージャーに感謝の意を表し、その支援と奨励に感謝する。