3.06.4.1.1 Levure Saccharomyces

Des études précoces avaient montré que la levure Saccharomyces pouvait fermenter le xylulose en éthanol, mais pas de manière efficace. Ainsi, théoriquement, il ne manque à la levure Saccharomyces que l’enzyme ou les enzymes permettant de convertir le xylose en xylulose. Comme décrit ci-dessus, les bactéries convertissent le xylose en xylulose à l’aide d’une seule enzyme qui ne nécessite pas de cofacteurs (figure 3). En revanche, le système de conversion du xylose en xylulose de la levure nécessitait deux enzymes dont le métabolisme n’est pas idéal, comme décrit ci-dessus. Au départ, près de 10 laboratoires différents dans le monde ont tenté de cloner un gène de xylose isomérase bactérienne dans la levure. Ho et al. de l’Université Purdue ont été le premier groupe à réaliser le clonage du gène de la xylose isomérase d’Escherichia coli. Cependant, la protéine synthétisée dans la levure par le gène bactérien cloné n’avait aucune activité xylose isomérase.

Une deuxième approche a consisté à cloner les gènes XR et XD de P. stipitis dans la levure Saccharomyces. Cependant, la cinétique de ces enzymes et l’équilibre thermodynamique de la réaction favorisent la production de xylitol au lieu d’éthanol. Au début des années 1990, trois groupes (Kotter, Ciriacy et leurs collègues de l’université de Düsseldorf, Tantirungkij et ses collègues de l’université d’Osaka, et Hahn-Hägerdal et ses collègues de l’université de Lund) ont signalé le clonage réussi des gènes XR et XD dans la levure Saccharomyces pour la rendre capable de fermenter le xylose. Cependant, la levure recombinante développée par ces groupes a fermenté le xylose extrêmement lentement et a produit peu d’éthanol ; le principal produit métabolique était le xylitol.

Le groupe Ho a émis l’hypothèse que la surexpression de la xylulokinase native (XK) ainsi que de XR et XD de P. stipitis améliorerait le flux de xylose à travers le métabolisme en éthanol en diminuant la concentration intracellulaire de xylulose. Comme la xylulokinase catalyse une réaction irréversible vers la production d’éthanol (figure 3), une activité xylulokinase élevée entraînera de faibles concentrations de xylulose. Ceci est souhaitable car l’équilibre de la réaction catalysée par XD favorise le xylitol, et de faibles concentrations de xylulose à l’état d’équilibre sont nécessaires pour diriger le flux métabolique vers la production d’éthanol. En outre, le clonage de ces trois gènes a permis de contrôler leur expression dans la cellule. Dans le système natif de contrôle de l’expression de la cellule, leur expression est induite par la présence de xylose et est inhibée par le glucose. La levure recombinante qui en résulte pourrait être capable de co-fermenter simultanément le glucose et le xylose en éthanol sans la longue période de latence entre la fermentation du glucose et celle du xylose, ce qui serait extrêmement souhaitable pour la production industrielle d’éthanol.

En 1989, le groupe Ho de Purdue a rapporté pour la première fois le clonage du gène de la xylulokinase de la levure Saccharomyces. Par la suite, le groupe Ho a remplacé les séquences d’ADN en amont des gènes structurels XR, XD et XK par des séquences en amont des gènes glycolytiques contenant des promoteurs constitutifs efficaces. Les gènes XR, XD et XK résultants ont été clonés sur un plasmide 2μ à nombre de copies élevé et le plasmide résultant, pLNH32, a été utilisé pour transformer une souche de levure Saccharomyces industrielle de type sauvage connue pour être supérieure pour la production d’éthanol en utilisant l’amidon (glucose) comme matière première. En 1993, le même groupe a rapporté le développement réussi de la levure Saccharomyces recombinante 1400 (pLNH32) qui pouvait fermenter des concentrations élevées de xylose presque complètement en éthanol avec très peu de xylitol comme sous-produit. De plus, la levure résultante peut co-fermenter le glucose et le xylose en éthanol sans qu’il y ait de période de latence entre la fermentation de ces deux sucres, bien que la vitesse de fermentation du xylose soit plus lente que celle du glucose (Figure 4). Par la suite, les détails de la construction et du développement du 1400 (pLNH 32) ont été rapportés. Depuis lors, le groupe Ho a continué à améliorer la levure avec diverses approches nouvelles, comme décrit ci-dessous.

Figure 4. (Gauche) Souche de levure Saccharomyces 1400 transformée avec le plasmide parent de pLNH32 contenant soit aucun gène XR, XD ou XK, soit contenant uniquement XR et XD, mais pas XK, utilisée pour fermenter un mélange de glucose et de xylose. (A droite) Levure 1400 transformée avec le plasmide pLNH32, contenant les gènes XR, XD et XK clonés. La levure a été utilisée pour fermenter le glucose et le xylose dans des conditions identiques aux résultats décrits dans la figure de gauche. Les gènes clonés dans ces plasmides ont été modifiés et construits de manière identique à celle décrite dans la référence 9.

Le plasmide 2 μ, pLNH32, contenant le gène XR-XD-XK cloné est un plasmide hôte large conçu pour pouvoir transformer toutes les souches de levure Saccharomyces, y compris la levure Saccharomyces de type sauvage industrielle. Un tel plasmide peut être utilisé pour sélectionner de meilleurs hôtes pour la production d’éthanol cellulosique. Le groupe Ho a également mis au point une nouvelle technique unique d’intégration de gènes qui facilite l’intégration efficace de plusieurs gènes dans le chromosome de la levure en plusieurs copies. Cette technique est facile à réaliser et elle garantit presque que les gènes clonés sur le plasmide d’intégration et transformés dans les cellules de levure hôtes peuvent être intégrés dans le génome de l’hôte en autant de copies que souhaité pour fournir les meilleures activités (figure 5). Cette technique d’intégration a été utilisée pour développer la souche 1400 (LNH-ST), qui fermente le xylose de façon stable, en intégrant d’abord les gènes XR-XD-XK ensemble sous forme de cassette dans le chromosome de la levure en un nombre suffisant de copies pour que la levure résultante fermente le xylose avec la plus grande efficacité (figure 6). La meilleure souche actuellement développée par le groupe Ho, 424A (LNH-ST), a été sélectionnée parmi 10 souches différentes de levure Saccharomyces en transformant d’abord chaque souche avec le plasmide 2 μ pLNH32 pour s’assurer que ces souches étaient capables de fermenter le xylose et de co-fermenter efficacement le glucose/xylose en présence de pLNH32, puis en intégrant des gènes dans les chromosomes des souches de levure sélectionnées pour développer la  » levure stable  » par cette nouvelle technique d’intégration. La co-fermentation du glucose/xylose par 424A (LNH-ST) est illustrée à la figure 7.

Figure 5. Démonstration de l’intégration par étapes de copies multiples de gènes XR-XD-XK dans les chromosomes de la souche 259 de levure Saccharomyces par la méthode décrite dans Ho et al. . Des levures à différents stades d’intégration ont été utilisées pour fermenter le glucose et le xylose dans des conditions identiques afin de démontrer la progression de l’intégration de ces gènes : a) Au stade initial de l’intégration, b) 25 % d’achèvement, c) 50-75 % d’achèvement, d) après achèvement de l’intégration. L’achèvement de l’intégration se traduit par des cellules issues du processus d’intégration produisant les mêmes résultats de fermentation pendant une période suffisamment longue.

Figure 6. Co-fermentation de glucose et de xylose avec 1400 (LNH-ST) contenant des copies multiples de gènes XR-XD-XK intégrés dans les chromosomes de levure par la méthode de Ho et al. .

Figure 7. Co-fermentation de glucose et de xylose avec la souche de Saccharomyces recombinante 424A (LNH-ST) contenant des copies multiples des gènes XR-XD-XK intégrés dans les chromosomes de levure de la souche 424A de Saccharomyces par la méthode de Ho et al . Il s’agit de la meilleure levure Ho-Purdue développée à l’Université Purdue avant 2007 et actuellement fournie à l’industrie pour la production d’éthanol cellulosique.

Si un micro-organisme recombinant est utilisé pour une production industrielle à grande échelle, comme pour la production d’éthanol, il est nécessaire d’intégrer les gènes à cloner dans les chromosomes de l’hôte pour deux raisons essentielles. La première est que si les gènes clonés sont intégrés dans les chromosomes hôtes par une méthode fiable, les gènes clonés peuvent être maintenus sur le chromosome hôte sans nécessiter l’utilisation de produits chimiques, de milieux, d’antibiotiques et d’additifs spéciaux. La nécessité d’utiliser des produits chimiques ou des antibiotiques pour maintenir les caractères n’ajoute pas seulement le coût des produits chimiques, mais aussi le coût et la difficulté du processus d’approbation réglementaire et du nettoyage de tout effluent. Même en présence d’un agent sélectif, les plasmides à nombre élevé de copies, tels que pLNH32, utilisés pour cloner les gènes dans les cellules hôtes pourraient ne pas être en mesure de soutenir une opération industrielle à grande échelle. Le groupe Ho a montré que la levure stable développée à l’aide du nouveau système d’intégration, 1400 (LNH-ST), était capable de soutenir la fermentation continue d’hydrolysats de canne de maïs en éthanol dans une usine pilote, alors que la même souche de levure contenant le plasmide, 1400 (pLNH32), en était incapable.

La souche 424A (LNH-ST) et d’autres souches stables, 1400 (LNH-ST) et 259 (LNH-ST), développées par la nouvelle technique d’intégration, ont toutes été validées par d’autres et se sont avérées durables et efficaces pour la production d’éthanol cellulosique avec des hydrolysats provenant de différentes matières premières lignocellulosiques. La souche 424A (LNH-ST) est également utilisée industriellement pour la production d’éthanol cellulosique à partir de résidus agricoles dans une usine de démonstration depuis 2004.

La levure recombinante développée par Hahn-Hägerdal a été largement améliorée par le clonage de différents gènes supplémentaires, y compris le clonage du gène de la xylulokinase après que le groupe Ho de l’Université de Purdue ait démontré que l’expression accrue de ce gène natif améliore les rendements en éthanol à partir du xylose .

La levure développée par le groupe Ho de Purdue est disponible pour la production industrielle d’éthanol cellulosique. Elle aura probablement de bonnes chances de réussir, car il s’agit d’une levure productrice d’éthanol industriel, et elle a été testée de manière extensive. Récemment, le groupe de Purdue a continué à améliorer la souche en la faisant co-fermenter l’arabinose avec les quatre autres sucres (glucose, xylose, mannose et galactose), et en la rendant plus résistante à l’éthanol et à l’acide acétique.

Même si la première tentative de développement d’une levure Saccharomyces fermentant le xylose à base de xylose isomérase n’a pas été couronnée de succès et qu’une levure modifiée fermentant le xylose à base de XR/XD efficace avait été développée, l’intérêt pour le développement d’une levure fermentant le xylose à base de xylose isomérase s’est maintenu au fil des ans, en partie parce que cette voie ne présente pas de déséquilibre redox. En 2009, Brat et al. ont construit une S. cerevisiae capable de fermenter le xylose en utilisant la xylose isomérase de Closteidium phytofermentans. Toujours en 2009, Cargill a signalé le développement d’une souche de levure non-Saccharomyces exprimant la xylose isomérase et capable de fermenter efficacement un mélange de glucose et de xylose à un faible pH et en présence de 1% d’acide acétique.

Même si l’arabinose n’est présent qu’en petites quantités dans la biomasse des graminées en tant que partie de l’hémicellulose GAX, quelques sources de biomasse spéciales telles que la fibre de maïs contiennent des quantités relativement importantes d’arabinose. Néanmoins, il est idéal d’avoir les microbes producteurs d’éthanol cellulosique capables de fermenter les cinq différentes molécules de sucre présentes dans la biomasse cellulosique, car le recyclage des flux de processus dans un processus industriel peut augmenter la concentration des composants mineurs .

Le mécanisme du métabolisme de l’arabinose dans les microorganismes est aussi compliqué que celui du xylose. Là encore, le mécanisme du métabolisme de l’arabinose chez la levure est différent de celui des bactéries . Comme pour le métabolisme du xylose, le mécanisme métabolique de la levure ne favorise pas le métabolisme anaérobie. Récemment, Hahn-Hägerdal et ses collègues ont modifié leur levure Saccharomyces, qui fermente le xylose, afin de co-fermenter l’arabinose avec le xylose et d’autres sucres par la voie fongique du l-arabinose. Cependant, la levure modifiée résultante était toujours incapable de fermenter l’arabinose en une quantité significative d’éthanol, mais était capable de convertir une petite quantité d’arabinose en arabitol.