Abstract

Des échantillons de sérum de 474 oiseaux sauvages, 378 chevaux et 42 humains atteints de méningite et de méningite lymphocytaire ont été collectés entre 2010 et 2014 dans différentes régions de Pologne. Les anticorps du virus du Nil occidental (VNO) ont été détectés à l’aide de tests immuno-enzymatiques de compétition : ELISA-1 ID Screen West Nile Competition, IDvet, ELISA-2 ID Screen West Nile IgM Capture, et ELISA-3 Ingezim West Nile Compac. Les anticorps ont été trouvés dans 63 (13,29 %) des 474 échantillons de sérum d’oiseaux sauvages et dans un (0,26 %) des 378 échantillons de sérum de chevaux. Quatorze (33,33%) des 42 sérums provenant de patients étaient positifs contre l’antigène du VNO et un sérum était douteux. Les échantillons positifs obtenus chez les oiseaux ont ensuite été soumis à un nouveau test de microneutralisation du virus pour confirmer les résultats positifs et les réactions croisées avec d’autres antigènes du complexe de l’encéphalite japonaise. Nous soupçonnons que les résultats sérologiques positifs chez les humains, les oiseaux et les chevaux indiquent que le WNV peut être en quelque sorte étroitement lié à l’écosystème en Pologne.

1. Introduction

Le virus du Nil occidental (VNO) peut affecter un large éventail d’espèces d’oiseaux, de chevaux et d’humains. Ce virus est un agent émergent responsable de maladies chez ces animaux et chez l’homme dans le monde entier. Les principaux vecteurs du VNO sont plusieurs espèces d’insectes suceurs de sang, qui peuvent transmettre le virus aux oiseaux, aux chevaux et aux humains.

Les infections se caractérisent par une pyrexie, une paralysie et une morbidité élevées causées par les facteurs jusqu’à présent reconnus comme pathogènes uniquement pour les animaux. Plus souvent, les infections sont caractérisées par des signes cliniques légers .

Le VWN figure sur la liste de l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE) comme facteur neurotrope causant la maladie dans le cadre de l’obligation de notification. La fièvre du Nil occidental (FNO) causée par le virus est une zoonose, qui constitue le principal problème de santé publique aux États-Unis .

LeWNV est un arbovirus appartenant à la famille des Flaviviridae, genre Flavivirus inclus dans le complexe antigénique de l’encéphalite japonaise induite par le virus de l’encéphalite japonaise (JEV), le virus de l’encéphalite de Saint-Louis (SLEV), le virus de l’encéphalite de la vallée de Murray (MVEV) et le virus Usutu (USUV) apparentés sur le plan antigénique. Le génome ssRNA+ du virus contient un seul cadre de lecture ouvert de 11.000 à 12.000 nucléotides. Le génome du virus se compose de sept protéines non structurelles, NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b et NS5, et de trois protéines structurelles : la glycoprotéine E, la protéine centrale C et la protéine prémembranaire prM .

Les oiseaux tropicaux et migrateurs, qui appartiennent à différentes espèces, sont le principal réservoir du virus . La lignée 1 du WNV est une lignée isolée dans le monde entier, mais la lignée 2 n’a été isolée qu’en Afrique et à Madagascar, jusqu’aux épidémies hongroises de WNV, qui ont été causées par une nouvelle lignée 2, qui a été introduite en Hongrie, très probablement par des oiseaux migrateurs d’Afrique, en 2004 . La même lignée 2 a provoqué à l’été 2010 une maladie neuro-invasive endémique (WNND) chez l’homme en Grèce, avec 262 cas confirmés et 35 décès. En 2011, le virus s’est propagé en Grèce centrale, mais avec moins de cas, 101 diagnostiqués et 9 décès. Le nombre total de personnes infectées par le virus en Grèce est estimé à 18000 .

Plus de 300 espèces d’oiseaux différentes ont été infectées par le VNO. Habituellement, le virus circule entre les oiseaux sauvages et les moustiques en cycle fermé et peut être transporté par les oiseaux lors de leurs migrations vers les différentes régions .

Le virus est présent dans de nombreux pays du monde et également dans 20 pays européens, y compris des pays, voisins proches de la Pologne, où la présence du virus a été confirmée . La présence d’anticorps du WNV a également été confirmée dans des échantillons de sérum d’oiseaux sauvages et d’humains en Pologne .

En 2010, la morbidité et la mortalité humaines causées par l’infection par le WNV ont été signalées en Grèce, en Russie, en Roumanie, en Italie et en Israël . la circulation du virus Usutu a également été confirmée en Pologne . Aucune autre étude n’a été publiée sur la circulation d’autres virus responsables du complexe de l’encéphalite japonaise en Pologne.

Le but de l’étude était la détection d’anticorps du WNV dans des échantillons de sérum provenant de différents oiseaux sauvages, de chevaux et de patients hospitalisés présentant des symptômes neurologiques.

2. Matériaux et méthodes

Oiseaux. Echantillons de sérum de 474 oiseaux sauvages, 400 cigognes blanches (Ciconia ciconia), 21 faisans communs (Phasianus colchicus), 19 pinsoniers communs (Fringilla coelebs), neuf canards sauvages (Anas platyrhynchos), quatre pygargues à queue blanche (Haliaeetus albicilla), deux grands tétras occidentaux (Tetrao urogallus), six pigeons voyageurs (Ectopistes migratorius), trois autour des palombes (Accipiter gentilis), deux corneilles à capuchon (Corvus cornix), trois autour des palombes (Accipiter gentilis), ainsi qu’un martinet noir (Apus apus), un merle noir (Turdus merula), un étourneau sansonnet (Sturnus vulgaris), un grand corbeau (Corvus corax) et une buse variable (Buteo buteo), ont été collectés dans différents endroits en Pologne (Jardins zoologiques, Centre de réhabilitation des animaux protégés). Cependant, la plupart des échantillons proviennent du Centre de réhabilitation des oiseaux sauvages de la Fondation Albatros. Les échantillons ont été collectés entre mars et octobre, de 2010 à 2014, lorsque l’activité du moustique était la plus élevée (Figure 1).

Figure 1

Carte de la Pologne. Zones où les échantillons ont été collectés.

Chevaux. 378 échantillons de sérum ont été obtenus à partir de chevaux domestiques sains provenant de quelques ranchs situés dans quatre districts. Les échantillons de sérum ont été prélevés également sur des chevaux de course (figure 1).

Humain. Echantillons de sérum provenant de 42 patients (17 hommes et 25 femmes) du département des maladies infectieuses et des neuroinfections de l’université médicale de Bialystok. Les patients présentaient des symptômes neurologiques caractéristiques de la méningite, de la méningite lymphocytaire et de l’encéphalite à tiques. Ils ont été hospitalisés entre mai et septembre 2010. Tous les patients ont été testés pour les anticorps du virus de l’encéphalite à tiques par Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemens . Les échantillons ont été conservés à -20°C.

Tous les échantillons examinés ont été vérifiés deux fois et testés dans des conditions de biosécurité de niveau 3+.

ELISA-1. L’étude sérologique a été réalisée avec une compétition disponible dans le commerce, ELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, France), pour la détection des anticorps du virus du Nil occidental contre les protéines d’enveloppe pr-E et pr-M contenant un épitope commun au virus de l’encéphalite japonaise, conformément au protocole du fabricant. Tous les échantillons ont été examinés deux fois. Les microplaques ont été lues à 450 nm. Le test ELISA a été validé lorsque les rapports de liaison résiduels (S/N%) ont été calculés. Les échantillons de sérum dont le rapport S/N est inférieur ou égal à 40 % ont été considérés comme positifs ; les échantillons dont le rapport est supérieur à 50 % ont été considérés comme négatifs. Les valeurs S/N comprises entre 40 % et 50 % étaient douteuses.

L’ELISA-2 a été réalisé à l’aide de l’ID Screen West Nile IgM Capture (Innovative Diagnostics, Montpelier, France). Les puits ont été recouverts d’un anticorps polyclonal IgM. Lorsque les résultats étaient positifs, la présence d’anticorps apparaissait sous forme de solution bleue et après l’ajout de la solution d’arrêt devenait jaune. En l’absence d’anticorps, aucune coloration n’apparaissait. Les plaques ont été lues à 450 nm.

L’ELISA-3 a été réalisé en utilisant le test enzymatique Ingezim WNV Compac (Ingenasa, Espagne) basé sur l’ELISA bloquant, dans lequel un anticorps monoclonal (MAb) spécifique à la protéine E du WNV a été utilisé. Si des anticorps étaient présents dans les échantillons de sérum, ils se sont liés à l’antigène. Lorsque l’AcM spécifique à la protéine E a été ajouté, il s’est lié à l’antigène qui n’a pas été bloqué par les anticorps de l’échantillon de sérum. En cas d’anticorps bloquant l’antigène, le conjugué ne s’est pas lié. Le test a été lu par une réaction colorimétrique après l’ajout du substrat. Les échantillons ont été considérés comme positifs lorsque les valeurs de la DO étaient égales ou inférieures à celles des échantillons de sérum de contrôle positif. Les échantillons ont été considérés comme négatifs lorsque la valeur de la DO était égale ou supérieure au seuil négatif. Les échantillons dont la valeur de DO se situait dans la fourchette des deux valeurs étaient considérés comme douteux.

Test de microneutralisation virale. Le test de microneutralisation virale avec des échantillons positifs ELISA provenant d’oiseaux sauvages a été réalisé dans le laboratoire de référence européen, ANSES, France. Des cellules Vero et le virus du Nil occidental, souche IS-98-ST1, ont été utilisés dans le test. Le test était basé sur la procédure standard de l’OIE.

3. Résultats

Les districts de Pologne et les zones où les échantillons ont été collectés sont indiqués dans la figure 1.

La plupart des échantillons ont été prélevés sur les oiseaux pendant l’assignation et les traitements vétérinaires. Certains des oiseaux se trouvaient au centre de réhabilitation après des accidents. Les oiseaux ne présentaient aucun symptôme de maladie neurologique ni aucun signe d’infection neurologique. Chaque oiseau a été fourni par l’organisation qui a envoyé les échantillons avec les informations sur le lieu, le sexe, l’âge, et quand c’était possible, sur l’histoire du voyage.

Les examens des échantillons de sérum ont révélé des anticorps spécifiques du VNO dans 63 échantillons provenant d’oiseaux sauvages : 62 de cigognes blanches et un de pinson commun. Un échantillon de sérum positif a été obtenu à partir d’une jument.

Concernant les échantillons de sérum humain, 14 sur 42 étaient positifs et un était douteux. Tous les patients avaient des antécédents de piqûres de moustiques et de tiques. L’encéphalite transmise par les tiques a été diagnostiquée chez 16 patients.

Pour confirmer les résultats, un test ELISA-2 a été effectué pour détecter les anticorps spécifiques IgM du WNV dans le sérum comme première ligne de réponse immunitaire. Les résultats étaient négatifs et n’ont donc pas confirmé la présence d’anticorps IgM ou toute preuve d’infection récente des animaux.

Pour vérifier les résultats obtenus par ELISA-1, ELISA-3 a été effectué, et la présence d’anticorps spécifiques du VNO a été confirmée dans ces cas. Les résultats sont présentés dans le tableau 1.

Pour confirmer les résultats positifs, les échantillons de sérum positifs des oiseaux ont été retestés par le test de microneutralisation du virus. Les 63 échantillons de sérum d’oiseaux sauvages ont été confirmés et identifiés comme positifs pour les anticorps du VNO avec le titre 10 dans 60 échantillons et le titre 30 dans trois échantillons. En ce qui concerne les examens des autres membres du JECV, les échantillons étaient également négatifs pour le virus Usutu. Aucune réaction de réactivité croisée n’a été observée.

La comparaison des résultats obtenus par les différentes méthodes de diagnostic (ELISA et tests de microneutralisation du virus) est présentée dans le tableau 1.

4. Discussion

Au cours des dernières années, il a été noté que le WNV se propage dans les pays à climat modéré. les moustiques de la famille Culicidae sont le vecteur le plus commun de la propagation du virus et aujourd’hui six des espèces de moustiques existent dans la zone climatique polonaise . Dans les années 90 du siècle dernier, Juřicová et al. ont confirmé, à l’aide d’un test d’inhibition de l’hémagglutination, la présence d’anticorps du VNO chez 12,1 % des moineaux domestiques (Passer domesticus) et chez 2,8 % des moineaux eurasiens (Passer montanus) dans la zone forestière de Campinas en Pologne. Les années suivantes, des anticorps anti-VNO ont été trouvés chez trois cigognes, un corbeau (Corvus corone cornix) et un cygne tuberculé (Cygnus olor) sur l’autre partie de la Pologne .

Nous avons réalisé trois ELISA différents pour présenter puis confirmer les résultats obtenus. Le premier ELISA était ID Screen West Nile Competition, test spécifique du WNV, mais il donne aussi des réactions sérologiques croisées entre les membres du JECV. Lorsque des résultats positifs ont été obtenus, on a effectué le test ELISA-2 West Nile IgM Capture, qui est spécifique uniquement au WNV et permet d’exclure les réactions croisées mais ne détecte que les IgM. Cela signifie que nous ne pouvons identifier qu’une infection récente et que nous ne pouvons pas détecter les anticorps IgG. L’ELISA-3 a été utilisé pour confirmer les résultats obtenus par l’ELISA-1 et les résultats ont été confirmés dans 100% des cas.

Dans notre étude, les résultats positifs avec les échantillons de sérum d’oiseaux sauvages obtenus par les ELISA ont été confirmés par le test de microneutralisation du virus. De plus, l’ELISA a révélé la présence d’anticorps anti-VNO dans 14 des 42 échantillons de sérum provenant de patients présentant des symptômes de méningite, de méningite lymphocytaire et d’encéphalite à tiques, mais nous n’avons pas pu vérifier les résultats obtenus avec le test de neutralisation par réduction de plaque (PRNT). L’infection par le VNO chez l’homme et l’identification du VNO dans le liquide céphalorachidien sont généralement confirmées par RT-PCR, Nested PCR , ou par RT-PCR dans les tissus humains fixés au formol et inclus en paraffine. Selon l’étude de Czupryna et al, tous les échantillons de liquide céphalorachidien de 24 patients hospitalisés au département des maladies infectieuses et des neuroinfections de l’université médicale de Bialystok étaient négatifs pour l’ARN du VNO.

Les échantillons de sérum des humains, des oiseaux et des chevaux ont été utilisés comme échantillons appropriés pour déterminer les anticorps spécifiques du VNO. Si nous confirmions la présence d’anticorps spécifiques dans les échantillons de sérum, l’animal ou l’homme était considéré comme ayant été en contact avec le virus (en Pologne ou en dehors du pays). On suppose que les oiseaux sauvages positifs pourraient avoir été en contact avec le virus en dehors du pays. En ce qui concerne les échantillons humains positifs, 11 patients n’ont jamais quitté le pays, ce qui signifie qu’ils ont dû entrer en contact avec le virus dès leur arrivée en Pologne. Il en est de même pour les chevaux qui, d’après leur historique de voyage, n’ont jamais quitté le pays.

Sur la base de la situation épidémiologique en Europe, du rôle des oiseaux sauvages dans la transmission du VNO et des résultats des examens sérologiques précédents chez l’homme et les oiseaux, la présence du VNO en Pologne est possible. En Pologne, les anticorps du WNV ont été détectés chez des femmes fébriles et des travailleurs forestiers en bonne santé des régions de Swietokrzyskie (28,85%) et Podlaskie (34,14%). Nos résultats sérologiques peuvent suggérer que le virus est déjà présent dans notre zone climatique et dans notre écosystème. La possibilité de sa réaction croisée avec les virus de l’encéphalite à tiques et de la maladie endémique doit être prise en considération.

Approbation éthique

L’étude a été approuvée par la II commission locale d’éthique de Lublin (numéro 92/2010 du 16 novembre 2010) et a obtenu l’autorisation du directeur général de la protection de l’environnement (numéro DOP-OZGŁZ. 6401.03.36.2011.dł).

Conflit d’intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le soutien financier fourni par un projet de travail cadre P/020, Les oiseaux d’eau vivant librement en tant que réservoir et le vecteur pendant l’expansion des maladies virales, et le projet de travail cadre W/211, Développement de méthodes de diagnostic et évaluation du risque de l’occurrence de l’infection par le virus du Nil occidental chez les oiseaux en Pologne (2014-2018).