Les effets mesurés de Wnt3a sur la prolifération des cellules HEK293T dépendent de l’essai appliqué
Abstract
La voie de signalisation Wnt a été associée à de nombreux processus cellulaires essentiels. Cette étude vise à examiner les effets de la signalisation Wnt sur la prolifération des cellules HEK293T en culture. Les cellules ont été incubées avec Wnt3a, et l’activation de la voie Wnt a été suivie par l’analyse du niveau de la protéine β-caténine et des niveaux d’expression des gènes cibles MYC et CCND1. Le niveau de la protéine β-caténine a été multiplié jusqu’à quatre fois. Alors que les niveaux d’ARNm de c-Myc et de cycline D1 ont légèrement augmenté, les niveaux de protéines ont augmenté jusqu’à un facteur de 1,5. Il est remarquable que les tests MTT et BrdU aient donné des résultats différents lors de la mesure du taux de prolifération des cellules HEK293T stimulées par Wnt3a. Dans les tests BrdU, une augmentation du taux de prolifération a pu être détectée, ce qui était en corrélation avec la concentration de Wnt3a appliquée. A l’inverse, cette corrélation n’a pas pu être mise en évidence dans les tests MTT. Les résultats du MTT, qui sont basés sur l’activité mitochondriale, ont été confirmés par l’analyse du complexe succinate déshydrogénase par immunofluorescence et par western blotting. Dans l’ensemble, notre étude montre que Wnt3a active la prolifération des cellules HEK293. Ces effets peuvent être détectés par la mesure de la synthèse d’ADN plutôt que par la mesure des changements de l’activité mitochondriale.
1. Introduction
La voie de signalisation Wnt est connue pour jouer un rôle clé dans la régulation de la différenciation, la prolifération, la survie et l’apoptose cellulaires . Les protéines Wnt sont une famille hautement conservée de glycoprotéines sécrétées, modifiées par des lipides et riches en cystéine, qui activent des cascades de signalisation à l’intérieur de la cellule en se liant à un membre de la famille Frizzled (Fz) des récepteurs couplés aux protéines G sur la matrice extracellulaire . Il existe 19 membres de Wnts vertébrés, qui peuvent être regroupés en deux classes principales en fonction de leur capacité à stabiliser la β-caténine cytosolique : la voie canonique et la voie non canonique. Des travaux récents ont également montré que certains ligands de Wnt, comme Wnt5a, sont capables d’activer plus d’une seule voie de signalisation Wnt , de sorte que la classification strictement binaire est de plus en plus dépassée. Le dysfonctionnement de la voie de signalisation Wnt est lié à plusieurs maladies comme l’ostéoporose , la maladie de Crohn , la maladie d’Alzheimer , la schizophrénie , et surtout le cancer .
Le ligand Wnt3a appartient à la signalisation Wnt dépendante de la β-caténine (canonique), qui se lie aux récepteurs transmembranaires frizzled. Par la suite, le complexe de récepteurs LRP5 (low-density lipoprotein receptor-related protein 5) ou LRP6 active les protéines échevelées cytoplasmiques, qui déclenchent l’inhibition de la glycogène synthase kinase 3β (GSK-3β). La protooncoprotéine β-caténine s’accumule dans le cytoplasme à la suite du désassemblage du complexe de destruction formé par l’adénomatose polypose colique (APC), AXIN et GSK-3β. Ainsi, la β-caténine peut être transloquée dans le noyau où elle active la transcription de gènes cibles médiée par le facteur de transcription spécifique des cellules T (TCF)/le facteur de renforcement des lymphes (LEF) . Ces gènes sont responsables de la régulation de processus physiologiques essentiels dans le développement embryonnaire et adulte tels que la prolifération cellulaire, la différenciation, la morphogenèse et l’adhésion cellulaire .
Avec l’indication de la prolifération, il existe une interaction complexe entre la signalisation Wnt canonique et le cycle cellulaire. La voie de signalisation Wnt/β-caténine est significative dans la stimulation de la progression de la phase G1 en inhibant GSK-3β, qui régule les effecteurs du cycle cellulaire et les régulateurs de croissance .
Un gène cible direct de la voie de signalisation Wnt/β-caténine est le protooncogène MYC, qui a été identifié comme une cible Wnt dans les cellules du cancer du côlon . Le régulateur de transcription c-Myc contrôle de nombreuses fonctions cellulaires, notamment la régulation de la progression du cycle cellulaire. Le gène codant pour la cycline D1, CCND1, est également un gène cible de la voie Wnt/β-caténine, qui a été décrit dans les cellules cancéreuses du côlon. La cycline D1 en tant qu’activateur de la kinase dépendante de la cycline (cdk) 4 ou cdk 6 conduit la transition de phase G1/S .
Il existe plusieurs façons de mesurer la prolifération cellulaire induite par Wnt3a. Une méthode non radioactive est un immunodosage basé sur l’incorporation de 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) dans l’ADN pour déterminer la synthèse de l’ADN, qui est corrélée à la transition de phase S et donc à la prolifération cellulaire . Une autre méthode utilise la mesure de l’activité mitochondriale des cellules viables. Dans le test MTT, un produit bleu formazan insoluble est produit par les déshydrogénases mitochondriales par réduction du MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium) .
Dans cette étude, nous avons étudié la prolifération des cellules HEK293T sous l’influence des ligands de Wnt3a en utilisant le test MTT ainsi que le test BrdU. De plus, nous comparons les résultats de ces tests avec l’activité mitochondriale des cellules traitées par Wnt3a, mesurée par immunomarquage de la protéine de la chaîne de transport d’électrons SDHA (sous-unité A du complexe de la succinate déshydrogénase).
2. Matériaux et méthodes
2.1. Cellules et culture cellulaire
Les cellules rénales embryonnaires humaines, HEK293T, ont été cultivées dans du milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum bovin fœtal (PAN Biotech, Aidenbach, Allemagne), 1% d’acides aminés non essentiels et 1% de pénicilline/streptomycine (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) à 37°C et 5% de CO2.
2.2. Essais de prolifération
Les essais de MTT et de BrdU ont été réalisés sur des plaques à 96 puits. Dix mille cellules ont été ensemencées par puits et les cellules ont été stimulées avec des doses croissantes de Wnt3a (R&D Systems, Minneapolis, USA), à savoir 0, 10, 50, 100, 150 et 200 ng/mL, pendant 24, 48 et 72 h. Le MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) a été dissous dans du PBS à 5 mg/mL et 20 μL de solution de MTT ont été ajoutés à chaque puits, suivis d’une incubation de trois heures à 37°C dans 5% de CO2. Le milieu contenant le MTT a ensuite été éliminé par piquage et 200 μL de DMSO ont été ajoutés. Pour dissoudre les cristaux, les cellules ont été agitées pendant 15 min à température ambiante. Les plaques ont été lues par un lecteur ELISA (Tecan Group Ltd., Männedorf, Suisse) à 590 nm. Pour le dosage du BrdU, un kit commercial « Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric » (Roche, Mannheim, Allemagne) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. Après l’ajout de la solution de marquage BrdU, les cellules ont été incubées pendant trois heures à 37°C et à 5% de CO2. Après la dernière étape de lavage, 100 μL/puits de solution de substrat ont été ajoutés aux cellules et la réaction a été arrêtée après 15 min d’incubation à température ambiante en utilisant de l’acide sulfurique. Les plaques ont été lues immédiatement par un lecteur ELISA à 450 nm. Tous les essais ont été effectués en triplicata (). Pour l’étalonnage, les cellules ont été ensemencées en différents nombres (0,1 × 104 à 3 × 104).
2.3. Immunocytochimie et microscopie à fluorescence
Les cellules HEK293T ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et traitées avec 0-200 ng/mL de Wnt3a à une confluence de 30% et fixées dans du formaldéhyde à 4% après 24, 48 et 72 h. L’anticorps SDHA (Abcam, Cambridge, UK) à une dilution de 1 : 200 a été ajouté et les cellules ont été incubées pendant une heure. Les noyaux cellulaires ont été contre-colorés avec du DAPI pendant 5 minutes. Les cellules ont été analysées par microscopie à fluorescence (Observer. Z1 de Zeiss, Jena, Allemagne) et le logiciel d’accompagnement AxioVision 4.7.
2.4. Electrophorèse sur gel de protéines et Western Blot
Utilisant le test de Bradford, les concentrations de protéines dans les lysats de cellules entières ont été déterminées. Des quantités égales de protéines ont été chargées sur des gels de SDS-polyacrylamide (NuPAGE, 4-12%, Life Technologies, Carlsbad, USA). Les gels ont été passés à 150 V pendant 1 h et transférés sur des membranes de nitrocellulose via le système iBlot (Life Technologies). Les membranes ont été analysées à l’aide d’anticorps primaires contre SDHA, β-caténine, c-Myc, Cycline D1 et β-actine (Cell Signaling, Cambridge, UK), dilués au 1 : 1000 dans du TBS-Tween avec 3% de lait, suivis d’une incubation avec un anticorps secondaire approprié conjugué à la peroxydase de raifort (dilution 1 : 2000). Les bandes de protéines ont été visualisées en utilisant la détection ECL.
2.5. Isolation de l’ARN et RT-PCR
L’ARN total a été isolé à l’aide de NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne) et 1 μg d’ARN a été soumis à une transcription inverse avec Verso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne) dans un volume de 40 μL. Les séquences des amorces (MWG, Munich, Allemagne) utilisées pour la PCR semi-quantitative en transcription inverse sont pour GAPDH 5′-catggtgctgagatttgccaac-3′ (sens direct) et 5′-tcaaccttgaccttctcatcac-3′ (sens inverse), pour MYC 5′-ccgagcaaggacgcgactctc-3′ (en avant) et 5′-gcctttcagagaagcgggtcct-3′ (en arrière), et pour CCND1 5′-gcctgaacctgaggagcccca-3′ (en avant) et 5′-gtcacacttgatcactctgg-3′ (en arrière). L’amplification par PCR a été réalisée à l’aide de My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Allemagne) selon le protocole du fabricant. La réaction a été réalisée avec une dénaturation préliminaire pendant 2 min à 94°C, suivie de 30 cycles de dénaturation à 94°C pendant 1 min, d’annelage à 55°C (CCND1), 57°C (GAPDH), ou 60°C (MYC) pendant 30 sec, et d’extension à 72°C pendant 1 min. L’étape finale d’extension a duré 10 min à 72°C. Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1,5%.
2.6. Analyse des données
Le logiciel Microsoft Excel a été utilisé pour la gestion des données, y compris le calcul des écarts types.Les western blots et les gels d’agarose ont été scannés par le système de documentation de gel Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Allemagne). Les bandes ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, États-Unis).
3. Résultats
3.1. Effets de Wnt3a sur l’induction de la β-caténine et des gènes cibles typiques de Wnt
Afin de prouver l’activation de la voie Wnt, nous avons détecté la quantité de concentration de la protéine β-caténine dans les cellules HEK293T après traitement avec Wnt3a (Figure 1). Après 24 heures de traitement, la concentration en protéine β-caténine a augmenté avec les concentrations croissantes de Wnt3a. La plus forte concentration de protéine β-caténine a été identifiée à 24 heures avec une concentration de 200 ng/mL de Wnt3a. Ici, la quantification a montré une augmentation de quatre fois par rapport au contrôle. Aux points de temps 48 et 72 heures après le traitement, l’effet de l’induction de la β-caténine n’est plus clairement reconnaissable. De plus, nous avons analysé la régulation des gènes cibles de Wnt, CCND1 et MYC, après traitement avec Wnt3a, à la fois par RT-PCR semi-quantitative et par western blot (Figures 2 et 3). Un niveau basal de c-Myc et de cycline D1 a été détecté dans les cellules non traitées. Les résultats de la RT-PCR ont montré des changements marginaux dans la quantité d’ADNc de MYC et une induction de CCND1 après 24 et 48 heures avec 10 ng/mL de Wnt3a, ainsi qu’après 72 heures avec une concentration de 100-200 ng/mL de Wnt3a. Une légère augmentation du niveau de protéine de c-Myc a été observée avec une concentration de 50 ng/mL après 24 heures. La quantification par western blot de la cycline D1 a montré une augmentation d’un facteur 1,5 avec une concentration de Wnt3a de 50 à 200 ng/mL après 24 heures. Le niveau de protéine de c-Myc a augmenté de la même manière avec la concentration de 50 ng/mL de Wnt3a après 24 heures.
3.2. Essais de prolifération cellulaire
Pour étudier les effets des protéines Wnt sur la croissance cellulaire, les cellules HEK293T ont été cultivées dans des plaques à 96 puits pendant 24 heures avant d’être traitées avec des concentrations de protéines Wnt3a de 0, 10, 50, 100, 150 ou 200 ng/mL, respectivement. Après 24, 48 et 72 heures d’incubation, des tests MTT et BrdU ont été réalisés. Les tests BrdU montrent une tendance claire ; avec des concentrations croissantes de Wnt3a, la lecture associée a augmenté (Figure 4(a)), dans laquelle Wnt3a indique le taux de croissance le plus élevé après 48 heures et une concentration de 200 ng/mL.
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Contrairement aux essais BrdU, les essais MTT n’ont pas montré de corrélation entre les concentrations de Wnt et le nombre de cellules. Les nombres de cellules sont tous restés à peu près identiques ou ont diminué par rapport à leurs contrôles pertinents (voir la figure 4(b)).
3.3. Activité mitochondriale
Pour étayer davantage le rôle de Wnt3a relatif à l’activité mitochondriale dans les cellules HEK293T, les quantités de protéine SDHA ont été déterminées par western blot ainsi que par analyse immunocytochimique. La succinate déshydrogénase (SDH) avec sa sous-unité SDHA est un composant clé du cycle de l’acide citrique, qui participe au complexe II de la chaîne de transport d’électrons mitochondriale et est responsable du transfert des électrons du succinate à l’ubiquinone. Les cellules ont été traitées de la même manière que pour les expériences d’analyse de la prolifération et incubées avec l’anticorps SDHA comme décrit ci-dessus. Les résultats (Figure 5) ont montré un signal de fluorescence croissant et également un signal plus intense au western blot par rapport au contrôle après 24 heures de traitement par Wnt3a. Après 48 heures, le niveau de protéine enregistré par microscopie à immunofluorescence ou par analyse Western Blot n’a montré aucun changement significatif. Après 72 heures de traitement par Wnt3a, un signal décroissant a été observé dans les deux expériences. Le signal le plus élevé a été mesuré après 24 heures avec 50 ng/mL de Wnt3a.
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4. Discussion
Les protéines Wnt sont impliquées dans diverses fonctions cellulaires, y compris la régulation de l’expression génique pour le cycle cellulaire et la prolifération . Wnt3a est connu comme un promoteur de la prolifération et de la migration des cellules épithéliales du cristallin humain , également pour la prolifération des fibroblastes ou comme un régulateur de la prolifération des cellules bêta NIT-1 pancréatiques . MYC et CCND1 sont des gènes cibles de la voie de signalisation Wnt dans les cellules de mammifères. Par exemple, Yoon et al. ont exposé que la signalisation Wnt active la biogénèse mitochondriale en réalisant un écran ARNi à grande échelle ; ils ont identifié des gènes qui affectent la fonction mitochondriale, entre autres MYC .
Dans ce travail, nous avons déterminé les effets de Wnt3a sur la prolifération des cellules HEK293T. Pour cela, nous avons appliqué deux tests majeurs, qui sont largement utilisés pour l’analyse des taux de prolifération des cellules en culture, à savoir les tests MTT et BrdU. Ce faisant, les effets spécifiques des ligands Wnt sur la synthèse de l’ADN et l’activité mitochondriale ont été détectés et comparés directement.
Afin d’établir notre système et de prouver l’effet de Wnt3a sur la voie Wnt dans les cellules HEK293T, nous avons démontré l’induction de la β-caténine après 24 heures de traitement par Wnt3a et nous avons analysé les niveaux d’expression de MYC et CCND1. Le niveau des deux gènes cibles a également augmenté après 24 heures d’exposition à Wnt3a. C-Myc joue un rôle clé dans la progression de la phase G1 ; elle régule à la hausse la cycline D1 et réprime p21 et p27 . La cycline D1 favorise à son tour la phosphorylation et l’inhibition du complexe rétinoblastome (Rb), qui lui-même régule à la hausse le niveau de la cycline E . L’enrichissement de la cycline E conduit à la transition du point de contrôle de la phase G1/S .
Pendant la phase G1, les mitochondries doivent fournir une grande quantité d’énergie . Cette phase oxydative est suivie d’une période réductrice pendant la phase S-/G2-/M du cycle cellulaire, dans laquelle la réplication de l’ADN et la prolifération des mitochondries ont lieu .
Les taux de prolifération des HEK293T traitées par Wnt3a étaient différents, lorsqu’ils ont été mesurés par les deux tests utilisés dans cette étude. Nous expliquons cette différence par les mécanismes de détection dissemblables de ces méthodes. Le test MTT mesure l’activité des mitochondries, tandis que le test BrdU détecte la quantité relative d’ADN nouvellement synthétisé. Wagner et al. font référence à une relation hautement significative entre BrdU et MTT dans leurs résultats sur la prolifération des lymphocytes canins, bien que le test BrdU s’avère plus sensible que le test MTT . L’effet apparemment négatif de Wnt3a sur le nombre de cellules pourrait s’expliquer par une diminution de l’activité mitochondriale. Le test BrdU, cependant, a montré un effet promoteur sur la synthèse de l’ADN dans ces cellules. Les expériences de l’activité mitochondriale ont montré que seulement après 24 heures de traitement par Wnt3a, le niveau de SDHA était augmenté. L’activation avec Wnt3a recombinant n’a probablement aucun effet sur l’activité mitochondriale après 48 heures ou plus. La diminution du signal lors du test MTT après 48 et 72 heures témoigne de cet effet limité dans le temps. Ceci est également confirmé par l’accumulation décroissante de la β-caténine par Wnt3a après 24 heures. D’autres publications soutiennent cette hypothèse selon laquelle les cellules traitées par Wnt3a indiquent une augmentation du niveau de β-caténine uniquement pendant une période de 24 heures . Nous expliquons nos résultats, qui sont contraires à l’effet proliférant publié de Wnt3a par le fait que la plupart des études ont utilisé des cellules surexprimées par Wnt3a, un milieu conditionné par Wnt3a, ou des cellules privées de sérum avec une protéine Wnt recombinante pour l’activation de la voie de signalisation Wnt/β-actine.
En conclusion, les résultats des tests BrdU et MTT sont difficilement comparables lors de la mesure des effets de Wnt3a sur le taux de prolifération des cellules HEK293T. Les différences peuvent être expliquées par leurs différents points d’application, à savoir l’activité mitochondriale et la synthèse de l’ADN. Afin de fournir des preuves définitives sur le taux de prolifération cellulaire, l’interprétation des résultats d’une seule méthode peut être trompeuse. Pour évaluer la prolifération cellulaire, le comptage direct des cellules par des méthodes optiques reflète le mieux la situation réelle. Il serait intéressant de comparer les résultats correspondants avec les résultats des tests biochimiques comme le BrdU et le MTT.
Conflit d’intérêts
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.
Reconnaissance
Ce travail a été soutenu financièrement par le ministère fédéral de l’éducation et de la recherche (BMBF).