La WWOX est située sur le bras long du chromosome 16 dans un site fragile connu. Il est composé de neuf exons et mesure >1 Mb.1 Le transcrit canonique (ENST00000566780.5, NM_016373.3) code pour une protéine ubiquitaire de 414 acides aminés (aa) fortement exprimée dans la prostate, les gonades, le sein, le poumon, les tissus endocriniens et le cerveau21,22. L’épissage alternatif de la WWOX pendant le traitement de l’ARN messager précurseur (pré-ARNm) génère huit transcrits qui n’ont été observés que dans les cancers ; on ne sait pas si chaque ARNm aberrant de la WWOX est traduit en protéine.23 L’oxydoréductase contenant le domaine WW est la seule protéine qui couple deux domaines distincts avec des homologies élevées avec la famille des domaines WW et la superfamille SRD. La WWOX possède deux domaines WW à l’extrémité amino-terminale, un motif de signal de localisation nucléaire (NLS) et un domaine C-terminal de déshydrogénase-réductase à chaîne courte (SDR) (Fig. 1b). Un motif de séquence de ciblage mitochondrial (MTS) a également été cartographié dans le domaine SDR entre l’aa 209 et l’aa 273 (réf. 24). WWOX contient également un site de liaison de coenzyme, NAD(H) ou NADP(h) (GANSGIG, aa 131-137), et un site de liaison de substrat potentiel (YNRSK, aa 293-297) (réf. 1). Le domaine C-terminal de WWOX (aa 125-414) est similaire à une région d’interaction MAPT (http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZC7).

Variants pathogènes germinaux de WWOX identifiés chez des patients présentant des troubles constitutionnels liés à WWOX (SCAR12, syndrome de WOREE et DSD). a Variations du nombre de copies (n = 12). DSD disorder of sex development, IF in frame, OOF out of frame, WOREE WWOX-related epileptic encephalopathy. b Variations mononucléotidiques (n = 23). MTS mitochondrial targeting sequence, NLS nuclear localization signal, SRD short-chain dehydrogenase reductase.

WWOX est tolérant aux variations missense avec une métrique de contrainte missense Z = -3,19 (Exome Aggregation Consortium).20 De nombreux CNV hétérozygotes affectant tout ou partie de ce gène sont observés dans des échantillons témoins sains (Database of Genomic Variants).25 Le nombre élevé de variations pathogènes/probablement pathogènes dans les bases de données publiques n’est pas surprenant compte tenu du mode d’héritage autosomique récessif de l’encéphalopathie liée au WWOX.

Le WWOX est exprimé dans le système nerveux en développement de la souris, y compris le cortex cérébral et le cervelet, des stades in utero à l’âge adulte.26 Des modèles animaux ont montré une épilepsie et une ataxie causées par la perte de WWOX,3,27 suggérant un processus neurodégénératif. Dans une revue détaillée de la littérature, Aldaz et ses collaborateurs ont clairement démontré que WWOX est au carrefour du cancer, du syndrome métabolique et de l’encéphalopathie.28

Les données cliniques et moléculaires de tous les patients de la littérature présentant les phénotypes SCAR12 ou WOREE sont décrites dans le tableau supplémentaire 3 (réf. 3,4,5,6,7,8,29,30). Deux autres patients, des sœurs d’une famille arabe consanguine présentant un variant homozygote WWOX (c.1228G>T ; p.Gly410Cys), ont également été signalés par Alkhateeb et al. en 2016 (réf. 9), mais un doute subsiste quant à la pathogénicité du variant identifié dans ces cas. Tous deux présentaient un retard de langage et l’un d’entre eux était épileptique depuis l’âge de 2 ans. La présentation clinique dans cette famille est très légère par rapport au syndrome de WOREE observé chez les patients présentant des variants germains pathogènes bialéliques dans WWOX. Ce changement de glycine en cystéine à la position 410 affecte un acide aminé à la toute fin du côté de l’extrémité carboxyle de la protéine. De plus, ce changement d’acide aminé est présent sous forme homozygote chez deux individus dans l’ensemble de données gnomAD. Bien que les prédictions in silico soient en faveur de la pathogénicité de ce variant missense pathogène (possiblement endommagé par PolyPhen-2), son rôle causal est discutable dans cette famille. Nous avons donc décidé d’exclure ces patients de notre revue de la littérature.

Nous rapportons ici la plus grande cohorte d’individus présentant un phénotype WOREE composée de 20 patients supplémentaires présentant des variants pathogènes bialéliques dans WWOX hérités de parents sains (Tableau supplémentaire 1). Les diagnostics moléculaires ont été obtenus par une combinaison de différentes techniques (array-CGH, qPCR/MLPA, séquençage Sanger ciblé, ES et WGS). En regroupant nos patients avec tous les cas rapportés jusqu’à présent dans la littérature, on connaît 37 patients de 27 familles présentant un syndrome de WOREE et des variants pathogènes WWOX bialéliques. Un total de 29 allèles pathogènes/probablement pathogènes différents (10 CNV et 19 SNV) ont été identifiés (Fig. 1a, b). Les introns 5 et 8 du gène WWOX sont très grands avec une taille de 220 et 780 Kb respectivement. Ils couvrent 90 % de la séquence génomique WWOX et contiennent des points de rupture de translocation pour le myélome multiple28, conformément au fait que les grandes régions introniques sont souvent recombinogènes et sujettes aux points de rupture chromosomique. Par conséquent, la duplication (un allèle) et la délétion (cinq allèles) englobant les exons 6 à 8 sont les CNV pathogènes les plus fréquents observés chez les patients atteints de troubles liés à la WWOX (tableaux supplémentaires 1 et 3). Tous les patients issus de familles consanguines (10/27 ; 37 %) se sont révélés homozygotes pour le même allèle délétère, un phénomène courant dans les troubles autosomiques récessifs à faible prévalence. La forte proportion de familles présentant un génotype comprenant un ou deux CNV pathogènes (14/27 ; 52%) souligne la nécessité d’une approche quantitative pour le dépistage du locus WWOX chez les patients atteints de troubles graves du système nerveux central. Chez les patients hétérozygotes pour un CNV affectant plusieurs exons, il est important de rechercher (1) un éventuel génotype hétérozygote composé pour deux petits CNV et la nécessité d’une seconde analyse quantitative par MLPA ou qPCR chez les deux parents et (2) un SNV sur le second allèle par séquençage Sanger ciblé. De même, lorsque le séquençage de l’ES ou du panel de gènes ciblés est réalisé en première intention, la recherche de CNV est essentielle dans ce grand gène sujet aux délétions et aux duplications, impliquant tout ou partie de ses séquences codantes.

Dans cette étude, nous rapportons huit nouveaux variants pathogènes missens (tableau supplémentaire 2). Parmi les résultats du séquençage à haut débit de l’exome et du panel de gènes ciblés, les variants missens WWOX sont nombreux. Leur pathogénicité est difficile à établir car WWOX a de nombreuses fonctions et partenaires protéiques. Nous avons suivi les directives de l’American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)31 pour interpréter et annoter les variations faux-sens dans les données WWOX afin de les classer comme pathogènes, probablement pathogènes, variantes de signification inconnue (VUS), probablement bénignes ou bénignes. Pour faciliter notre processus d’interprétation des variantes, nous avons utilisé un outil en ligne disponible en libre accès (http://www.medschool.umaryland.edu/Genetic_Variant_Interpretation_Tool1.html/) pour classer efficacement les variantes sur la base des catégories de preuves définies par les directives de l’ACMG.31 Quatre changements d’aa (p., p., p., p.) sont associés en trans à des variantes nulles dans un gène où la perte de fonction est un mécanisme pathologique connu. Tous les variants faux-sens identifiés chez les personnes atteintes d’encéphalopathie liée au WWOX (11 changements d’aa dans 12 familles, tableau supplémentaire 2) sont prédits comme étant pathogènes par une combinaison de logiciels basés sur Internet. Plus important encore, aucun n’est présent à l’état homozygote dans gnomAD.20 Tous les variants faux-sens sont classés comme pathogènes ou probablement pathogènes selon les recommandations de l’ACMG. Un patient (P19) est porteur de trois variants pathogènes faux-sens différents : p. ; (Tableau supplémentaire 1). Les p.(Lys200Glu) et p.(Thr358Ile) sont situés en cis ; les deux changements d’acides aminés sont prédits comme étant probablement pathogènes bien que la thréonine en position 358 ne soit pas située dans un domaine fonctionnel connu. Il n’est pas possible de déterminer si l’un de ces variants ou les deux sont le variant faux-sens pathogène dans le P19. Dans la plupart des cas rapportés ici et publiés dans la littérature médicale, les variations de la séquence WWOX sont décrites au niveau de l’ADN de base. Tous les variants pathogènes faux-sens sauf un (P3 ; p.) sont interprétés sur la base d’études in silico sans preuve expérimentale (aucune séquence d’ARN ou de protéine analysée). Dans le cas de P3, l’analyse de l’ARN total par séquençage Sanger des produits de la PCR à transcription inverse (RT-PCR) n’a pas permis de détecter d’anomalie d’épissage dans les leucocytes. Aucune étude de l’ARN n’a été réalisée pour les autres patients car les échantillons sanguins appropriés n’étaient pas disponibles au moment du diagnostic moléculaire. Les SNV exoniques pourraient affecter les sites d’épissage accepteurs/donneurs physiologiques, mais aussi l’activateur d’épissage exonique (ESE) et le silencieux d’épissage exonique (ESS). De plus, l’activation de sites d’épissage cryptiques par des SNV est un mécanisme pathologique bien compris dans de nombreux troubles génétiques ; le syndrome de progéria de Hutchinson-Gilford en est un bon exemple.32 Les variantes faux-sens pourraient également avoir un impact sur la stabilité de l’ARNm.33 Jusqu’à 10 % des variantes faux-sens connues associées à des maladies, mais seulement 3 % des SNP courants, modifient l’épissage du pré-ARNm.33 Il est probable qu’une fraction des variantes faux-sens prédites identifiées chez les patients atteints d’encéphalopathie liée à l’oxyde de zinc entraîne une perte d’expression due à un épissage anormal. Ceci est d’autant plus probable pour un gène présentant des allèles pathogènes à perte de fonction. Pour les variants pathogènes missens du domaine SRD, l’absence de substrats identifiés rend difficile l’évaluation de leur impact sur l’activité catalytique de WWOX. La caractérisation de modèles animaux knock-in tels que le poisson zèbre donnerait des indices sur la pathogénicité des variants missense de WWOX.

Chez un patient non inclus dans cette étude, un diagnostic moléculaire d’encéphalopathie liée à WWOX a été initialement suspecté devant un génotype bialélique constitué de deux SNV en trans : un non-sens (ENST00000566780.5:p.Gln72*) et un variant missense (ENST00000402655:c.600T>A, p.Ser200Arg). Le changement d’aa en position 200 affecte uniquement une protéine WWOX non-RefSeq de 311 résidus. Jusqu’à présent, tous les changements d’aa pathogènes ont été décrits en fonction de la protéine WWOX canonique (414 aa), qui résulte de la traduction d’un transcrit à 9 exons (ENST00000566780.5, isoforme 1). On ignore si l’isoforme de la protéine WWOX composée de 311 résidus est pertinente pour les troubles liés à la WWOX. De plus, le phénotype de ce patient était léger par rapport au syndrome de WOREE. Pour ces raisons, nous avons décidé de ne pas considérer ce génotype comme responsable de l’encéphalopathie chez ce patient.

WWOX, cancer et maladie pulmonaire?

WOX est un gène suppresseur de tumeur impliqué dans la modulation des voies liées au cancer via des interactions protéine-protéine entre les domaines WW et diverses protéines oncogènes. La perte de la protéine WWOX a été trouvée dans de multiples néoplasies.23 Des ostéosarcomes et des carcinomes pulmonaires sont observés chez les souris Wwox-/-22 et la tumorigenèse est l’une des conséquences d’un génotype hypomorphe de Wwox.34 Une perte fonctionnelle de copie CNV (67048) dans WWOX a été significativement associée à un risque accru de cancer dans les populations chinoises35,36,37. Plus récemment, il a été démontré que la perte d’expression de WWOX dans le poumon de souris provoquait une inflammation neutrophile.38 Il est surprenant de constater que l’augmentation des cas de cancer n’a jamais été signalée, ni chez les patients présentant des variants pathogènes germinaux WWOX bialéliques, ni chez leurs parents hétérozygotes. La sévérité du syndrome de WOREE avec une fréquence élevée de décès prématurés dans les premières années de vie pourrait expliquer l’absence de tout cancer. Cette explication n’est pas convaincante pour les patients hétérozygotes pour un allèle WWOX nul. L’ablation de Wwox n’est pas tumorigène dans tous les modèles animaux knockout ; ce gène suppresseur de tumeur putatif est plus susceptible d’être pertinent dans la progression des tumeurs plutôt que dans leur initiation au cours de l’oncogenèse. Cette étude confirme que les altérations germinales de WWOX ne sont pas des variants pathogènes conducteurs importants pour l’initiation et/ou la progression du cancer.

WWOX et DSD

WWOX est fortement exprimé dans les tissus à régulation hormonale tels que l’hypophyse, le testicule et l’ovaire, et est présumé jouer un rôle dans la biosynthèse des gonadotrophines ou des stéroïdes sexuels1,39. On pense que le domaine enzymatique SRD de la WWOX joue un rôle dans le métabolisme des stéroïdes avec des substrats encore non identifiés. Ces observations et la description de deux modèles différents de souris knockout WWOX présentant des anomalies gonadiques34,39 soutiennent clairement un rôle de la WWOX dans le développement des gonades.

Le premier réarrangement germinal de la WWOX chez l’homme était associé à un DSD 46, XY.2 Le patient présentait un tissu gonadique indifférencié bilatéral et des testicules immatures. Il était hétérozygote pour une délétion des exons 6 à 8 héritée de sa mère qui avait des antécédents personnels de ménarche tardive. Cette CNV est censée entraîner une délétion in-frame, provoquant un produit raccourci avec le domaine SRD largement absent. Plus récemment, trois VUS hétérozygotes dans le gène WWOX ont été identifiés par ES chez des patients atteints de DSD (Fig. 1) (réf. 40). A notre connaissance, le DSD n’a pas été rapporté chez les parents hétérozygotes de patients atteints du syndrome de WOREE et nous pensons que l’implication des SNVs/CNVs hétérozygotes dans l’étiologie moléculaire du DSD est discutable. L’atrophie testiculaire, la fertilité réduite, les anomalies gonadiques, le dysfonctionnement des cellules de Leydig et l’altération du développement mammaire font partie des phénotypes observés dans plusieurs modèles animaux d’ablation de la WWOX.28 A notre connaissance, le DSD n’est pas rapporté dans les modèles animaux d’ablation hétérozygote. Cependant, une possibilité demeure qu’un phénotype plus léger puisse être identifié après une évaluation minutieuse du développement sexuel et de la fonction gonadique chez les patients hétérozygotes pour un variant pathogène WWOX.

Phénotype SCAR12

En 2014, des variants pathogènes homozygotes faux-sens dans WWOX ont été identifiés par ES chez six patients de deux familles consanguines atteintes d’ataxie spinocérébelleuse autosomique récessive (SCAR12). Jusqu’à présent, cette association n’a pas été confirmée dans d’autres familles. Les patients atteints présentaient une ataxie cérébelleuse à début précoce, une épilepsie tonico-clonique généralisée, une déficience intellectuelle et une spasticité importante.3 Par rapport aux patients atteints du syndrome de WOREE, les patients présentant le phénotype SCAR12 ont un retard de développement moins sévère : tous étaient capables de marcher (4/4 ; 100 %), 3 sur 4 étaient capables de parler et aucun décès prématuré n’a été signalé. Lorsqu’elle a été réalisée, l’IRM cérébrale a montré une légère hypoplasie cérébelleuse (2/2 ; 100%) chez les patients affectés, une caractéristique non observée dans notre cohorte. Bien que l’épilepsie soit une caractéristique constante chez les patients SCAR12, les crises répondent plus souvent aux médicaments antiépileptiques (2/4 ; 50 %). L’atteinte oculaire était également présente avec un nystagmus signalé chez quatre patients. Cette forme d’ataxie cérébelleuse autosomique récessive liée à WWOX semble être une maladie génétique rare. La sévérité du phénotype WOREE et le décès prématuré d’une partie des patients pourraient cacher des problèmes d’équilibre liés à un dysfonctionnement cérébelleux. Des cas supplémentaires d’ataxie cérébelleuse liée à la WWOX sont nécessaires pour confirmer son implication dans ce trouble neurologique.

Phénotype deWOREE

Seulement après la description du phénotype SCAR12, la WWOX a été impliquée dans une forme récessive d’encéphalopathie épileptique infantile chez 17 patients de 9 familles.4,5,6,7,8,9,30 Nous faisons plus que doubler le nombre de cas avec 20 patients affectés dans 18 familles supplémentaires. Le phénotype de nos patients est cohérent avec celui des rapports précédents. Nous avons observé un taux de consanguinité plus faible dans notre cohorte, conformément à la proportion plus élevée de génotypes hétérozygotes composés décrits dans cette étude. Ces génotypes ont pu être manqués lors de la réalisation indépendante de l’array-CGH ou du séquençage à haut débit. La mise en œuvre de la prédiction de CNV à partir des données de séquence d’exome facilite l’identification des patients présentant des génotypes WWOX composés à la fois de SNV et de CNV.

Un fœtus présentant des anomalies cérébrales et de possibles crises intra-utérines a été signalé en 2015 (réf. 7). Des mouvements fœtaux diminués ont été occasionnellement rapportés dans notre série (3/20) alors que l’augmentation de la clarté nucale était le signe le plus fréquent pendant la grossesse dans les rapports précédents (4/17). Des contractures des mains et des pieds ont été signalées chez 5 patients de notre cohorte et chez 3 patients de la littérature4,5,6 pendant la période prénatale ou néonatale. La diminution des mouvements fœtaux, l’augmentation de la clarté nucale et les anomalies des mains ou des pieds pourraient être des signes prénataux de la maladie mais ne sont ni spécifiques ni fréquentes.

Contrairement à la littérature, le retard de croissance (6 %) et la microcéphalie (20 %) n’étaient pas des caractéristiques importantes chez nos patients qui présentaient une taille moyenne (-1,1 DS) et un CFO moyen (-1,4 DS) normaux. Un dysmorphisme a été signalé chez plus de la moitié des patients. Les caractéristiques les plus frappantes étaient un visage rond avec des joues pleines, un cou court et un aspect facial hypotonique (Fig. 2). Chez les patients P15 et P16, à un âge plus avancé, l’hypotonie faciale était toujours présente mais le visage devenait plus triangulaire. Les problèmes médicaux supplémentaires étaient une scoliose ou une cyphose d’apparition précoce (65%), qui pourrait orienter le diagnostic, ainsi que des troubles de l’alimentation nécessitant une sonde d’alimentation chez 70% des patients et des problèmes respiratoires (40%), comme on le voit dans d’autres encéphalopathies infantiles.

Tous les patients présentaient un retard de développement sévère. Aucun d’entre eux n’était capable de s’asseoir, de parler ou de marcher. L’examen neurologique a montré une hypotonie axiale et une hypertonie distale chez la plupart des patients. Des mouvements dystoniques étaient occasionnellement observés. Comme indiqué dans la littérature, tous les patients présentaient une épilepsie à début précoce (100 %) avec des crises quotidiennes et une résistance aux médicaments observée dans la plupart des cas (95 %). Il n’y avait pas de susceptibilité majeure aux crises fébriles. Le syndrome de West, caractérisé par des spasmes et une hypsarythmie enregistrée sur l’EEG, a été signalé chez 26 % des patients. Des crises focales, généralisées et combinées ont été observées. Des crises toniques, cloniques, tonico-cloniques et myocloniques ainsi que des spasmes et des absences infantiles ont été décrits. L’épilepsie était donc très sévère, d’apparition précoce et avec des fréquences de crises variables. Comme décrit précédemment, la déficience visuelle semble faire partie du spectre clinique du syndrome de WOREE. La plupart des patients atteints n’avaient aucun contact visuel (75 %). Environ la moitié d’entre eux présentaient un fond d’œil altéré (47 %) et/ou des tests électrodiagnostiques (45 %) évoquant une atrophie optique et/ou une dystrophie rétinienne. Un examen ophtalmologique précoce peut donc donner des indices diagnostiques chez les patients présentant des crises à début précoce et un retard de développement. L’IRM cérébrale (Fig. 3) était anormale chez 80% des patients, montrant principalement une hypoplasie du corps calleux (75%) et une atrophie cérébrale (55%). Nous avons confirmé dans notre cohorte que le décès prématuré est une caractéristique du syndrome de WOREE, survenant chez huit patients (40%) avec un âge moyen au décès de 40 mois. La sévérité de l’épilepsie et de l’atteinte neurologique peut être liée à la mort précoce des patients atteints.

Image de résonance magnétique cérébrale (IRM) d’individus atteints du syndrome d’encéphalopathie épileptique liée au WWOX (WOREE). a-j Corps calleux hypoplasique sur les plans sagittaux. k-q Atrophie cérébrale et espaces sous-arachnoïdiens élargis sur les plans axiaux (P4, P6, P14) et coronaux (P3, P7, P17). r-t Hypersignal symétrique de la substance blanche sur le T2 axial. u-v Plagiocéphalie et ventricule latéral asymétrique sur les plans T2 axiaux. w P19 lésions circulaires T1 sagittales (hyposignal) de la partie médiale du corps calleux. m mois, P patient, y année.

Les principaux signes cliniques chez les patients atteints de WOREE publiés précédemment sont résumés dans le tableau supplémentaire 4. Cette revue nous permet de conclure que WOREE est une encéphalopathie épileptique très sévère caractérisée par une faible mobilité spontanée, une absence de développement du langage et d’acquisition de la marche, des crises résistantes aux médicaments à début précoce, une atteinte ophtalmologique et une forte probabilité de décès prématuré. Les caractéristiques dysmorphiques (visage rond hypotonique, joues pleines et cou court) et la déformation de la colonne vertébrale peuvent être des signes associés précoces susceptibles d’appuyer le diagnostic.

Corrélations phénotype/génotype

Des corrélations phénotype/génotype ont récemment été suggérées pour les troubles neurodéveloppementaux liés à la WWOX5,7 avec une classification des génotypes WWOX en trois groupes. Selon cette classification provisoire, les patients porteurs de deux allèles nuls prédits étaient plus susceptibles de présenter le phénotype le plus sévère de WOREE, tandis que les génotypes hypomorphes avec deux variants faux sens entraîneraient plutôt une ataxie spinocérébelleuse (SCAR12). Le phénotype des patients porteurs d’un allèle nul et d’une variation pathogène faux-sens serait intermédiaire.5 Notre vaste étude permet de réévaluer ces corrélations préliminaires.

La présentation clinique la plus sévère semble être associée aux génotypes constitués de codons stop prématurés précoces correspondant à un knockdown complet de WWOX. Ces génotypes sont observés chez sept patients : délétion homozygote de l’exon 1 à 4 en P10, codons stop homozygotes p.(Arg54*) et p.(Trp44*),4,30 délétion homozygote des six premiers exons.7 Un décès prématuré avant 2 ans est survenu dans 5/7 cas et des anomalies cérébrales ont été détectées en période prénatale dans une famille. En outre, la mort prématurée n’a jamais été décrite chez les patients présentant un génotype de variante missense pathogène uniquement (tableaux supplémentaires 1 et 3). La caractérisation précise des variants faux sens et des CNV au niveau des protéines avec des études fonctionnelles pourrait donner des indices sur la façon dont les génotypes pourraient expliquer différentes présentations cliniques, notamment en ce qui concerne les phénotypes SCAR12/WOREE.

En conclusion, les variants pathogènes germinaux dans WWOX sont clairement associés à une encéphalopathie épileptique sévère à début précoce appelée syndrome de WOREE et nous rapportons ici la plus grande cohorte d’individus atteints de ce trouble neurologique. L’implication des variants WWOX constitutionnels dans le DSD et le SCA nécessite encore des études de réplication.