Etude biochimique et pharmacologique du venin de l’araignée-loup Lycosa singoriensis
ORIGINAL PAPER
Etude biochimique et pharmacologique du venin de l’araignée-loup Lycosa singoriensis
Liu ZHI ; Qian WII ; Li JI ; Zhang YI ; Liang SI
ICollege of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha, China
IIAdministrative Center for Basic Research, Ministry of Science ant Technology, China
Correspondence to
ABSTRACT
L’araignée-loup Lycosa singoriensis est une grande araignée venimeuse distribuée dans tout le nord-ouest de la Chine. Comme les autres venins d’araignées, celui de l’araignée-loup est un cocktail chimique. Sa teneur en protéines est de 0,659 mg de protéines/mg de venin brut, déterminée par la méthode de Lowry. L’analyse MALDI-TOF a révélé que les peptides du venin sont très diversifiés et peuvent être divisés en trois groupes caractérisés par trois plages moléculaires indépendantes : 2 000 à 2 500 Da, 4 800 à 5 500 Da et 7 000 à 8 000 Da, respectivement. Cette distribution moléculaire diffère sensiblement de celles de la plupart des venins d’araignées étudiés jusqu’à présent. Le venin de cette araignée-loup a une faible action neurotoxique sur les souris, mais il peut induire une hémolyse des érythrocytes humains. En outre, le venin présente une activité antimicrobienne contre les cellules procaryotes et eucaryotes.
Mots clés : araignée, Lycosa singoriensis, venin brut, MALDI-TOF, activité antimicrobienne.
INTRODUCTION
Il existe environ 39 000 espèces d’araignées décrites, et un nombre encore plus grand en attente de caractérisation. Presque toutes les araignées sont des prédateurs et possèdent des glandes à venin. La principale proposition des venins d’araignées est de tuer ou de paralyser les proies. Les venins d’araignées sont des cocktails chimiques complexes dans lesquels les peptides sont les principaux constituants de la plupart des venins d’araignées, à l’exception de ceux des araignées veuves noires qui contiennent une proportion élevée, supérieure à 100 kD, de protéines (1-3). Les peptides des venins d’araignées sont produits de manière combinatoire, ce qui conduit à un total estimé à environ 1,5 million de peptides de venins d’araignées. Par conséquent, les venins d’araignées sont une source riche de nouveaux composés intéressants sur le plan pharmacologique et agrochimique, qui ont fait l’objet d’une attention accrue de la part des pharmacologues et des biochimistes au cours des dernières années. Cependant, au cours des dernières décennies, seuls quelques venins d’araignée ont été étudiés de manière suffisamment détaillée, et donc moins de 0,01% des peptides de venin d’araignée ont été identifiés jusqu’à présent (4-7).
L’araignée-loup Lycosa singoriensis est une grande araignée distribuée dans tout le nord-ouest de la Chine. L’araignée femelle adulte a une longueur de corps de 28 à 40 mm (35±6 mm) et un poids corporel de 2,6 à 7 g (Figure 1). Cette araignée velue vit dans des trous souterrains. Son terrier, tapissé d’un tube de soie, a un diamètre de 2 à 4 cm et une longueur de 30 à 60 cm, et l’entrée du terrier est souvent recouverte d’un filet de soie. L’araignée passe la journée blottie au fond du trou, tandis qu’elle remonte le tube de soie et se cache près de l’entrée du terrier en attendant ses proies la nuit. Après avoir réussi à attraper des victimes, l’araignée les ramène dans le trou. Dans de nombreux cas, des résidus de petits insectes sont trouvés au fond du terrier. L’araignée-loup Lycosa singoriensis est également une araignée venimeuse et agressive. En 2000, on a signalé des morsures d’araignée-loup sur des humains et d’autres animaux dans la zone nord de la province du Xinjiang. Selon les dossiers cliniques, la majorité des morsures d’araignées ont causé des effets apparents, notamment des marques rouges et des douleurs autour des sites de morsure (8, 9).
Dans cette étude, nous rapportons les propriétés biochimiques et pharmacologiques du venin de l’araignée-loup Lycosa singoriensis. Comparé à de nombreux autres venins d’araignées étudiés jusqu’à présent, ce venin d’araignée présente certaines propriétés distinctes, ce qui en fait une source utile pour le criblage de pistes de médicaments et pour l’étude de la biodiversité des peptides de venin d’araignée.
MATERIELS ET METHODES
Araignées et collecte de venin
Les araignées Lycosa singoriensis femelles adultes ont été collectées dans la province du Xinjiang, en Chine, maintenues dans des seaux en plastique qui ont été recouverts de filets en plastique et ont reçu de l’eau quotidiennement. Des foies de porc hachés et des vers ont été utilisés pour nourrir les animaux. Comme beaucoup d’autres grandes araignées (10, 7), les Lycosa singoriensis deviennent facilement agressives lorsqu’elles sont provoquées par un morceau de tube en plastique. Elles le saisissent fermement, puis leurs crochets à venin percent le tube et injectent du venin à l’intérieur. On évite ainsi la stimulation électrique, qui peut contaminer le venin avec des enzymes provenant de la salive et des fluides digestifs. En utilisant cette méthode, on pourrait obtenir environ 50 mg de venin provenant d’environ 300 araignées Lycosa singoriensis, ce qui permettrait d’explorer les propriétés biochimiques et pharmacologiques du venin de cette araignée. Le venin brut est un liquide clair et incolore, facilement soluble dans l’eau et a été collecté toutes les deux semaines. Le venin brut lyophilisé a été stocké à -20°C avant d’être analysé.
Analyse SDS-PAGE du venin brut
L’électrophorèse en gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) sur le venin collecté a été réalisée dans des conditions dénaturées dans un gel en dalle de polyacrylamide à 10%. Cent microgrammes de venin lyophilisé ont été utilisés pour l’électrophorèse, et les protéines séparées dans le gel ont été visualisées par coloration G250.
Analyse MALDI-TOF du venin brut
L’empreinte du venin brut a été déterminée à l’aide d’une spectrométrie de masse par désorption laser assistée par matrice/ionisation à temps de vol (MALDI-TOF) (station de travail Voyager-DE STR Biospectometry®, Applied Biosystems, USA). L’ionisation a été réalisée par irradiation avec un laser à azote (337 nm) à une tension d’accélération de 20-kV ; l’acide α-cyano-4-hydroxy-cinnamique (CCA) a été employé comme matrice.
L’effet du venin brut sur les préparations isolées de synapse nerveuse
Trois types de préparations isolées de synapse nerveuse – nerf phrénique-diaphragme de souris, canal déférent de rat et cœur de crapaud – ont été utilisés pour étudier l’activité pharmacologique du venin brut. Les expériences de préparation de nerf phrénique-diaphragme de souris ont été réalisées selon Bülbring (11). Les essais sur le canal déférent et le cœur de crapaud ont été réalisés selon Liang et al. (12).
Essai hémolytique
L’activité hémolytique du venin brut a été testée avec des globules rouges humains héparinés, rincés trois fois dans 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS – 50 mM NaH2PO4 et 150 mM NaCl, pH 7,2) et centrifugés pendant 5 minutes à 3 000 rpm. Les globules rouges ont ensuite été incubés à température ambiante pendant 1 heure dans de l’eau déionisée (contrôle positif), dans du PBS (blanc), ou avec des venins à différentes concentrations (3,1 à 20 mg/mL) dans du PBS. Les échantillons ont été centrifugés à 12 000 rpm pendant 5 minutes. Le surnageant a été séparé du culot et son absorbance a été mesurée à 570 nm.
Activité antimicrobienne du venin brut
Six bactéries (Bacillus cereus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus albus et E. coli DH5) et deux champignons (Saccaromyces cerevisae et Candida albicans) ont été respectivement cultivés dans le milieu de culture jusqu’à atteindre la phase exponentielle avec une absorbance à 600 nm de 0,3 à 0,8. Cinquante microlitres de milieu ont été répartis uniformément sur trois plaques de gélose solidifiée. Les plaques ont été complétées avec 1,5 % d’agarose/milieu versé dans des boîtes de Pétri stériles de 100 × 20 mm. Un papier filtre de 6 mm de diamètre a recouvert les plaques. Cinq microlitres de solution de venin, dans du sérum physiologique, à différentes concentrations ont été placés sur le papier filtre. Après incubation à 37°C pendant une nuit, les effets du venin brut ont été enregistrés sous forme de cercles clairs dans le gazon bactérien sur le papier filtre.
Donc, dans ce test biologique, des solutions de venin brut à différentes concentrations (3 mg/mL, 6 mg/mL et 12 mg/mL) ont été déposées sur le papier filtre, et un cercle clair était détectable sur le papier si le venin à cette concentration avait inhibé la croissance microbienne.
RESULTATS ET DISCUSSION
Caractérisation biochimique du venin brut
Il a été constaté que chaque milligramme de venin brut contient environ 0,659 mg de protéines/peptides. Comme le montre la figure 2, les protéines de masse moléculaire élevée du venin brut sont réparties principalement entre des masses moléculaires allant de 14 à 31 000 Da, avec une bande protéique épaisse près de 20 000 Da et une autre bande évidente près de 14 000 Da. Une bande épaisse est également visible sur la partie supérieure du panneau du gel de SDS-PAGE, qui est constituée des peptides dont la masse moléculaire est inférieure à 10 000 Da. Les protéines/peptides distribués dans les deux liaisons épaisses sont les composants les plus abondants du venin brut, qui correspondent à 80% du composant protéique du venin brut.
Récemment, la spectrométrie de masse MALDI-TOF a été appliquée pour élucider la complexité des peptides du venin. De plus, avec le développement rapide de la spectrométrie de masse, cette technologie a été largement utilisée dans la recherche sur les venins (5, 13). Par exemple, Pierre Escoubas et al. (5) ont dressé un tableau des venins pour conceptualiser la complexité des venins d’araignées australiennes à toile en entonnoir en utilisant une approche combinée d’ADNc et de spectrométrie de masse. Leurs études démontrent que les venins de ces araignées contiennent plusieurs centaines de peptides qui suivent une distribution bimodale, avec la majorité des peptides dans la gamme de masse de 3 000 à 5 000 Da, et un second groupe moins prononcé dans la gamme de 6 500 à 8 500 Da. Cette distribution des masses moléculaires est analogue à celle observée précédemment pour un grand nombre de venins de tarentules (4). Des résultats similaires ont également été trouvés dans nos études précédentes sur les venins des araignées tarentules chinoises Ornithoctonus huwena, Ornithoctonus hainana et Chilobrachys jingzhao (14-16).
Comme présenté dans la figure 3, l’analyse par spectrométrie MALDI-TOF du venin brut de Lycosa singoriensis démontre que la distribution des masses moléculaires est observée de manière analogue dans la gamme de 1 000 à 10 000 Da. Cependant, contrairement aux espèces susmentionnées, les peptides du venin de Lycosa singoriensis peuvent être divisés en trois groupes en fonction de leur masse. Le premier groupe comprend les peptides qui possèdent des masses moléculaires comprises entre 2 000 et 2 500 Da, ce qui indique qu’ils ont environ 20 résidus d’acides aminés. Cette plage de masses moléculaires a rarement été observée dans la plupart des venins d’araignées étudiés à ce jour. Le deuxième groupe comprend principalement des peptides dont la masse moléculaire se situe entre 4 800 et 5 500 Da, ce qui suggère qu’ils sont composés d’environ 50 résidus d’acides aminés. Le troisième groupe est constitué de peptides dont la masse se situe entre 7 000 et 8 000 Da, ce qui correspond à plus de 60 résidus d’acides aminés. On estime que les peptides distribués dans ces deux derniers groupes constituent la majorité des peptides du venin.
Intéressant, assez peu de peptides ont des masses moléculaires comprises entre 3 000 et 5 000 Da. Paradoxalement, les peptides dans cette gamme de masse sont le composant le plus abondant dans de nombreux autres venins d’araignées. D’autres études seraient nécessaires pour élucider ces divergences, ce qui pourrait contribuer à la compréhension du mécanisme évolutif des peptides de venin d’araignée. L’étude actuelle contribue à prouver que les peptides de Lycosa singoriensis sont très diversifiés.
L’analyse des bibliothèques d’ADNc de la glande à venin a donné plus de 200 séquences de peptides de type toxine. La distribution de masse de ces peptides dérivés de séquences d’ADNc est cohérente avec celle observée par spectrométrie MALDI-TOF. De plus, l’analyse des séquences a révélé que les peptides du premier groupe ne comportent aucun résidu cystéine, que ceux du deuxième groupe contiennent 4 ou 5 liaisons disulfure, tandis que ceux du dernier groupe ont plus de 5 liaisons disulfure (données non publiées). La plupart des toxines peptidiques d’araignée identifiées jusqu’à présent ont généralement 3 ou 4 liaisons disulfure, et leurs structures 3D adoptent le motif classique du nœud cystine de l’inhibiteur. Par conséquent, il y a des raisons de croire que certains peptides du venin de Lycosa singoriensis posséderaient un nouveau thème structurel.
Caractérisation pharmacologique du venin brut
Le venin brut, à une dose élevée de 200 µg/mL, n’a pas pu bloquer la contraction stimulée électriquement de la préparation du diaphragme du nerf phrénique de la souris (n = 5). Il a également montré un faible effet sur la réponse à la contraction du canal déférent de rat. La concentration de 200 µg/mL de venin brut n’a pu inhiber que partiellement la réponse à la contraction pendant 20 minutes (n = 5) (figure 4 – A). En revanche, le venin brut de l’araignée O. huwena, à la même concentration, a été capable de bloquer rapidement la réponse à la contraction de la même préparation nerf-diaphragme ou du canal déférent de rat (données non présentées). Cependant, le venin brut de Lycosa singoriensis a eu un effet significatif sur la contraction du cœur du crapaud. En présence de 100 µg/mL de venin brut, la fréquence et l’amplitude des battements cardiaques ont été fortement augmentées (n = 5) (Figure 4 – B). Cela suggère que le venin brut contient certains composés qui sont cardiotoniques.
À l’heure actuelle, les agents cardiotoniques sont classés en trois classes en fonction de leurs mécanismes d’action subcellulaire, à savoir les agents agissant par des mécanismes en amont (mobilisateurs de Ca2+), ainsi que par des mécanismes centraux et en aval (sensibilisateurs de Ca2+). Ces agents induisent un effet inotrope positif en élevant la concentration intracellulaire en ions Ca2+ (17). A ce jour, il n’existe aucun rapport sur un effet cardiotonique des venins d’araignées-loups et aucun composé cardiotonique n’a encore été purifié et caractérisé à partir de ces venins. Par conséquent, il est important d’étudier les composés cardiotoniques du venin de Lycosa singoriensis.
L’activité hémolytique du venin brut a été déterminée en utilisant des érythrocytes humains frais. Comme le montre la figure 5 (A), le venin brut a perturbé les érythrocytes humains de manière dose-dépendante. Sa concentration efficace d’inhibition de 50 % (EC50) est de 1,25 mg/mL.
Comme rapporté par Budnik et al. (18), le venin brut de Lycosa singoriensis contient des peptides antimicrobiens (dénommés lycocitines 1, 2 et 3) qui peuvent inhiber la croissance des bactéries gram-positives et gram-négatives et des champignons à des concentrations micromolaires. Nous avons donc testé l’activité antimicrobienne du venin brut contre les cellules procaryotes et eucaryotes par le test d’inhibition de la croissance sur plaque. Dans les conditions de notre essai biologique, les souches cellulaires les plus sensibles au venin brut étaient, en particulier, Bacillus subtilis et Staphylococcus sp, dont la croissance était puissamment inhibée à 3 mg/mL. Le venin a également agi fortement contre Corynebacterium glutamicum et Micrococcus luteus mais faiblement contre l’une des souches de champignons (Candida albicans). Cependant, le venin brut n’a eu aucun effet détectable sur E. coli et Saccaromyces cerevisae, même à la concentration élevée de 12 mg/mL (Figure 5 – B).
Au cours des dix dernières années, de nombreux peptides antimicrobiens ont été identifiés à partir de venins d’araignées. Les lycotoxines I et II ont été identifiées à partir du venin de l’araignée-loup Lycosa carolinensis. Toutes deux sont des peptides antimicrobiens linéaires qui présentent le caractère amphipathique α-hélice typique des peptides porogènes. Leur mécanisme de formation de pores a été vérifié par la promotion de l’efflux d’ions calcium à partir des synaptosomes (19). Après les lycotoxines, les cupiennines (20-22) et les oxyopinines (23, 24), provenant du venin des araignées-loups Cupiennus salei et Oxyopes kitabensis, respectivement, se sont également avérées avoir des activités antimicrobiennes. Plus récemment, sept nouveaux peptides antimicrobiens et cytolytiques linéaires courts appelés latarcines ont été purifiés à partir du venin de l’araignée Lachesana tarabaevi. En outre, cinq nouveaux peptides qui partagent une similarité structurelle considérable avec les latarcines purifiées ont été prédits à partir de la base de données d’étiquettes de séquences exprimées pour la glande du venin d’araignée (25).
Ces peptides provenant de venins d’araignée appartiennent aux peptides antimicrobiens linéaires cationiques α-hélicoïdaux. Cette classe de peptides antimicrobiens partage certaines caractéristiques communes, comme l’inhibition de la croissance microbienne à de faibles concentrations micromolaires et la formation d’hélices amphipathiques et cationiques dans des environnements hydrophobes. Au cours des dernières décennies, un grand nombre de peptides antimicrobiens, dont des peptides antimicrobiens α-hélicoïdaux cationiques linéaires, ont été découverts chez les animaux ainsi que chez les plantes. Ces peptides sont généralement composés de 12 à 45 acides aminés et jouent un rôle important dans les systèmes immunitaires innés de la plupart des organismes vivants (26-28). La plupart d’entre eux peuvent tuer les micro-organismes avec les quatre caractéristiques suivantes : toxicité sélective, destruction rapide, large spectre antimicrobien et aucun développement de résistance (29-31).
En résumé, nous rapportons de nouvelles découvertes biochimiques et pharmacologiques sur le venin de l’araignée-loup Lycosa singoriensis. Les propriétés distinctes des peptides de ce venin en font un modèle idéal pour étudier les mécanismes évolutifs des peptides des venins d’araignées. L’étude pharmacologique de ce venin est utile pour purifier et caractériser les peptides bioactifs dans des études ultérieures.
ACKNOWLEDGMENTS
Ce travail a été soutenu par les projets de la National Science Foundation (30430170 et 30700127).
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