Dans cette étude, pour comprendre le rôle de la voie IRE1a-XBP1, notre stratégie de base a été d’utiliser un modèle de différenciation Th2 in vitro (Fig. 1b). Les cellules T helper naïves ont été activées par TCR dans des plaques recouvertes d’anti-CD3e/CD28 dans des conditions de différenciation Th2 pendant 72 h, reposées pendant 42 h, et restimulées par activation TCR en utilisant des plaques recouvertes d’anti-CD3e/CD28. Pour perturber la voie IRE1a-XBP1, nous avons utilisé un médicament bien établi, le 4μ8c, qui bloque spécifiquement la voie en inhibant l’activité endonucléase d’IRE1a . Le médicament a été ajouté aux milieux de culture à une concentration de 15-μM au début de la culture et lors du passage de la plaque d’activation à la plaque de repos. Le choix de la concentration du médicament a été déterminé par sa plus grande efficacité d’inhibition d’IRE1a avec la plus faible toxicité cellulaire (fichier additionnel 1 : figure S1). Nous avons comparé les transcriptomes des lymphocytes Th2 naïfs et restimulés (traités et non traités) par séquençage de l’ARN, identifié les sites de liaison du facteur de transcription XBP1 dans les Th2 réactivés par ChIPmentation (ChIP-séquençage), et intégré les données à l’échelle du génome pour prédire les cibles directes et leur rôle régulateur.

Les cellules T helper activent la voie IRE1a-XBP1 pendant l’activation in vitro

Les cellules T helper activées et différenciées sécrètent une abondance de cytokines. Par conséquent, une machinerie sécrétoire bien développée est une condition préalable à l’adaptation des cellules à ce stress sécrétoire. Pour prédire l’implication de la voie ER-stress/UPR pendant l’activation des cellules T helper, nous avons comparé le transcriptome des cellules Th2 naïves et différenciées (Th2 restimulées). Les gènes exprimés de manière différentielle, tels qu’obtenus par cette comparaison, ont été intégrés dans la voie KEGG « Protein Processing in the Endoplasmic Reticulum » afin de visualiser les composants qui sont régulés à la hausse ou à la baisse. L’analyse montre que lorsque les cellules T helper naïves sont activées et différenciées en cellules Th2, elles régulent à la hausse l’expression des gènes impliqués dans la voie du stress ER (fichier additionnel 1 : figure S2). Plusieurs facteurs qui ont été précédemment caractérisés comme des contrôleurs du repliement et de la sécrétion des protéines, y compris XBP1 lui-même, sont régulés à la hausse pendant la différenciation des cellules T helper.

Pour valider cette prédiction, et étudier spécifiquement l’implication de la voie IRE1a-XBP1, nous avons mesuré l’expression de l’ARNm et de la protéine IRE1a dans les lymphocytes Th2 différenciés et réactivés in vitro (Fig. 1b). Les cellules ont été analysées par qPCR et Western blot pour comparer l’ARNm et la protéine respectivement. Nous avons constaté que les niveaux d’ARNm et de protéines étaient régulés à la hausse dans les cellules T helper activées (Fig. 1c, panneau de gauche et panneau du milieu). Il est connu que la phosphorylation d’IRE1a indique son état fonctionnel. Nous avons observé que la protéine est phosphorylée dans les lymphocytes Th2 activés (Fig. 1c, panneau de droite). Cette augmentation de la phospho-IRE1a peut être expliquée par l’augmentation de la synthèse de la protéine, bien que nous ne puissions pas exclure la possibilité d’une activité kinase accrue et d’une auto-phosphorylation. L’analyse densitométrique de la bande Western blot suggère que les deux mécanismes, l’upregulation de la synthèse protéique et l’augmentation de la phosphorylation, sont impliqués. L’upregulation de la protéine a été multipliée par trois, mais la phospho-protéine a été multipliée par 4,5 (Fig. 1c).

L’IRE1a activée épisse l’ARNm XBP1 non épissé (XBP1u) et produit une isoforme d’ARNm XBP1 épissé (XBP1s). Nous avons observé une augmentation de la forme épissée de XBP1 (XBP1s), tant au niveau de l’ARNm que des protéines, lors de l’activation des cellules T helper (Fig. 1d, e). La tunicamycine a été utilisée comme contrôle positif. Il s’agit d’un médicament qui inhibe la glycosylation N-liée et provoque ainsi l’accumulation de protéines non repliées (c’est-à-dire le stress du réticulum endoplasmique (RE)), et augmente XBP1s en renforçant l’activité IRE1a. L’inhibition spécifique de l’activité endonucléase de l’IRE1a en traitant les cellules avec du 4μ8c a aboli les isoformes d’ARNm et de protéine XBP1s, confirmant que la formation de la forme épissée dépendait de l’activité de l’IRE1a (Fig. 1d, e).

Ces résultats confirment que la voie IRE1a-XBP1 est conservée dans les lymphocytes Th2 et régulée à la hausse pendant l’activation des cellules T helper in vitro. Pour vérifier si la voie IRE1a-XBP1 est opérationnelle dans les cellules T CD4+ in vivo, nous avons infecté des souris C57BL/6 avec le parasite helminthique Nippostrongylus brasiliensis, un modèle bien établi de réponses immunitaires dirigées par Th2. Après 7 jours post-infection, nous avons analysé l’expression de la protéine XBP1s dans les cellules T helper par cytométrie de flux. Nous avons constaté que les cellules T helper des souris infectées par le ver expriment significativement plus de XBP1s par rapport aux souris témoins non infectées, ce qui suggère une régulation à la hausse de la voie (Fig. 2).

Les cellules T helper régulent à la hausse la voie IRE1a-XBP1 in vivo pendant l’infection. Les splénocytes de souris infectées par le nématode (Nippostrongylus brasiliensis) (7 jours après l’infection) ont été colorés avec un anticorps anti-XBP1s conjugué au PE et analysés par cytométrie en flux (stratégie de déclenchement : singlet > cellules vivantes > CD4+CD3e+ > XBP1s+). Un profil FACS représentatif est affiché (panneau de gauche), et le graphique contenant tous les résultats (n = 4) est présenté dans le « panneau de droite »

Ces résultats confirment que la voie est active in vivo. Par conséquent, nous avons entrepris de disséquer la voie en utilisant des approches pangénomiques dans les lymphocytes Th2.

L’analyse transcriptomique pangénomique de l’expression différentielle des gènes révèle des gènes régulés par IRE1a-XBP1

Pour saisir un rôle de régulation génique global de la voie IRE1a-XBP1, nous avons comparé des cellules Th2 activées in vitro à des cellules dont l’activité endonucléase IRE1a est inhibée par l’ajout de 4μ8c dans les milieux de culture cellulaire. Nous avons ensuite comparé les transcriptomes des lymphocytes Th2 activés avec ou sans inhibition de la voie IRE1a-XBP1. Les transcriptomes des cellules Th2 traitées au 4μ8c et non traitées ont été obtenus par séquençage d’ARNm (RNA-seq). Le contrôle de qualité des données de séquençage de l’ARN est présenté dans le fichier supplémentaire 1 : Figure S3. En comparant les transcriptomes des lymphocytes Th2 naïfs et activés, nous avons constaté que 10995 gènes étaient régulés de manière différentielle lors de l’activation Th2. L’inhibition de la voie IRE1a-XBP1 par le traitement au 4μ8c a entraîné l’expression différentielle de 3144 gènes par rapport au contrôle Th2 non traité (figure 3a, fichier supplémentaire 1 : figure S3 panneau de droite). Deux mille six cent soixante-dix de ces gènes étaient impliqués dans la différenciation Th2 (Fig. 3a). Le regroupement hiérarchique des gènes révèle les groupes de gènes régulés à la hausse et à la baisse lors du traitement par le 4μ8c (fichier supplémentaire 1 : figure S3, à droite). Un examen détaillé de ces gènes a révélé que nombre d’entre eux étaient associés à la réponse aux protéines non pliées et au stress du RE, ce qui indique un impact majeur de la voie IRE1a-XBP1 (figure 3b) sur ces processus biologiques. La liste complète des gènes différentiellement exprimés se trouve dans le fichier supplémentaire 2 : tableau S1. L’analyse de l’ontologie génique (GO) de ces gènes différentiellement exprimés lors du traitement au 4μ8c des cellules Th2 (c’est-à-dire les gènes régulés par la voie IRE1a-XBP1) a montré qu’ils sont enrichis dans les processus biologiques suivants :  » Réponse au stress ER  » (GO:0006950),  » Régulation de la transduction du signal  » (GO:0009966),  » Production de cytokines  » (GO:0001816),  » Prolifération cellulaire  » (GO:0008283),  » Cycle cellulaire  » (GO:0007049) et Réponse immunitaire (GO:0006955) (figure 3c). Ces changements dans les profils d’expression génique lors de l’inhibition d’IRE1a suggèrent une implication importante du facteur de transcription XBP1 dans l’activation et la prolifération des Th2, ainsi que dans la différenciation. Par conséquent, nous avons entrepris de trouver les schémas d’occupation chromatinienne à l’échelle du génome du facteur de transcription XBP1.

Expression différentielle des gènes dans Th2 due à l’inhibition de IRE1a-XBP1 par 4μ8c. Des cellules T helper naïves ont été activées dans des conditions de différenciation Th2 en présence ou en l’absence de 4μ8c. Les cellules ont été activées dans des plaques recouvertes d’anticorps anti-CD3e et anti-CD28 pendant 3 jours, reposées pendant 2 jours, et réactivées dans des plaques recouvertes pendant 6 h. Les données RNAseq ont été analysées pour l’expression différentielle des gènes. a Diagramme de Venn montrant le nombre de gènes différentiellement exprimés dans différentes conditions expérimentales.  » Naïf → Th2  » indique les gènes différentiellement exprimés entre les auxiliaires T naïfs et les cellules Th2.  » Th2 → Th2+4μ8c  » indique les gènes différentiellement exprimés entre les Th2 non traitées et les Th2 traitées au 4μ8c. b Carte thermique montrant les gènes différentiellement exprimés qui sont bien connus pour être impliqués dans la résolution du stress ER imposé par la réponse aux protéines non repliées. La carte thermique montre les valeurs d’expression mises à l’échelle, désignées par le score Z de la ligne, dans une échelle de couleur rouge-bleu, le rouge indiquant une expression accrue et le bleu une expression réduite. c Analyse d’ontologie génique (GO) des gènes différentiellement exprimés entre les Th2 et les Th2 traités par 4μ8c

La ChIPmentation de XBP1 révèle les gènes cibles directs de XBP1 dans les cellules Th2

Pour identifier l’occupation chromatinienne de XBP1 à l’échelle du génome, nous avons réalisé une ChIPmentation, une méthode récemment développée qui s’est avérée plus rapide, plus sensible et plus robuste que les approches ChIP-seq traditionnelles , en utilisant un anticorps de qualité ChIP contre XBP1. Des cellules Th2 différenciées et réactivées in vitro ont été utilisées pour la ChIP de XBP1. Deux répétitions biologiques indépendantes ont été effectuées. Nous avons obtenu 19,3 millions et 22,4 millions de lectures par paire pour chaque réplique respectivement. En utilisant MACS2 avec une valeur q inférieure à 0,01 et un enrichissement en plis supérieur à 5, nous avons identifié 9031 et 7662 pics, respectivement, dans les deux répliques. L’analyse des chevauchements à l’aide de bedtools a suggéré que 5892 pics étaient présents dans les deux répliques. Par conséquent, nous nous sommes uniquement concentrés sur ces 5892 pics pour l’analyse en aval.

Comme prévu, des pics de liaison ont été identifiés autour des régions promotrices des gènes cibles connus de XBP1, tels que Hspa5 qui code la protéine BiP de l’ER-chaperone également connue sous le nom de Grp78 ; un événement de liaison a également été observé autour du promoteur de XBP1 lui-même (Fig. 4a), indiquant une autorégulation potentielle de XBP1. Pour découvrir les caractéristiques génomiques associées aux sites de liaison de XBP1, nous avons comparé l’emplacement de son pic aux gènes RefSeq en utilisant HOMER . La majorité des pics de liaison de XBP1 étaient situés dans les régions promotrices (définies comme 1000 pb en amont et 500 pb en aval par rapport aux sites de début de transcription annotés) (36%) et introniques (35%), et des événements de liaison intergéniques distaux (25%) ont également été fréquemment observés (Fig. 4b). La distribution génomique des pics de XBP1 indique qu’il se lie à la fois aux promoteurs et aux exhausteurs potentiels.

Occupation chromatinienne à l’échelle du génome du facteur de transcription XBP1 dans le lymphocyte Th2. La ChIPmentation de XBP1 a été réalisée dans des cellules Th2 différenciées in vitro afin d’obtenir une occupation chromatinienne de XBP1 à l’échelle du génome. a Instantané des pics de liaison de XBP1 autour des gènes représentatifs indiqués provenant du navigateur de génome UCSC. b Distribution génomique des pics de liaison de XBP1. Le secteur correspondant au promoteur comprend des séquences jusqu’à 1 kb en amont et 100 pb en aval du TSS. c Comparaison des motifs de XBP1 provenant de la base de données JASPAR (en haut), de ChIP-seq de lignées cellulaires de cancer du sein humain (au milieu) et de lymphocytes Th2 de souris (en bas). d Fréquences de motifs de XPB1 et NF-Y autour des pics de liaison de XBP1. e Termes GO des processus biologiques enrichis dans les pics de liaison de XBP1 analysés par GREAT

Pour caractériser davantage le régulome de XBP1, nous avons effectué une découverte de novo de motifs en utilisant HOMER pour identifier les motifs ADN enrichis dans les régions de liaison de XBP1. Le principal motif identifié est la séquence consensus GCCACGT, qui est presque identique au motif de liaison de XBP1 humain défini dans les lignées cellulaires du cancer du sein (Fig. 4c). Cela indique que les spécificités de liaison de XBP1 sont hautement conservées entre l’homme et la souris et entre les types de cellules. Le motif le plus enrichi dans nos données sur les souris ressemble également au motif XBP1 de la base de données JASPAR, ce qui confirme la grande qualité de nos données de ChIPmentation. Le deuxième motif le plus enrichi est le motif de liaison NF-Y (fichier supplémentaire 1 : figure S4C). Il est intéressant de noter que le motif NF-Y a été fréquemment trouvé autour des régions promotrices des gènes du cycle cellulaire, en particulier les gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire G2/M . Le motif XBP1 et le motif NF-Y sont tous deux présents autour d’un sous-ensemble de 258 pics de liaison XBP1 (figure 4d), ce qui indique une coopération potentielle entre les facteurs de transcription XBP1 et NF-Y pour réguler un sous-ensemble de gènes cibles. La liste des gènes cibles qui sont potentiellement co-régulés par XBP1 et NF-Y est affichée dans le fichier supplémentaire 3 : tableau S2, et une liste complète des cibles de XBP1 est également fournie dans le fichier supplémentaire 3 : tableau S2. Les cinq motifs les plus enrichis sont affichés dans le fichier additionnel 1 : Figure S4C. Pour étudier les fonctions des gènes liés à XBP1, nous avons utilisé GREAT pour caractériser les pics de liaison de XBP1. La plupart des termes GO significatifs sont liés au repliement des protéines et au stress du RE (figure 4e), ce qui est cohérent avec le rôle biologique connu de XBP1.

Ensemble, les expériences de ChIPmentation prédisent un rôle de XBP1 dans l’amélioration du repliement et de la sécrétion des protéines, ainsi que dans l’activation des lymphocytes Th2.

Intégration des données transcriptomiques et des données ChIP-seq pour démêler le réseau de régulation génique contrôlé par XBP1

Pour révéler les gènes cibles directs régulés par XBP1 et son réseau de régulation transcriptionnelle, nous avons intégré les données transcriptomiques à l’échelle du génome et les données de ChIPmentation. Un gène cible direct est défini par son expression différentielle lors de l’inhibition de l’IRE1a (c’est-à-dire le traitement au 4μ8c) et l’occupation du facteur de transcription XBP1 au locus du gène. Nous avons trouvé 1143 gènes cibles directs dans Th2, dont 122 cibles avaient déjà été signalées comme cibles directes de XBP1 dans d’autres types de cellules (c.-à-d., muscle, cellule β pancréatique et cellule plasmique) (Fig. 5a). Dans ce contexte, 1021 gènes peuvent être considérés comme spécifiques de Th2. L’action de XBP1 sur ses cibles directes n’a pas de direction définie, contenant des gènes régulés à la hausse et à la baisse. Les 38 principaux gènes qui suivent l’un ou l’autre de ces schémas sont présentés dans la figure 5b, et la liste complète se trouve dans le fichier supplémentaire 4 : tableau S3. Le processus biologique et les voies identifiés les plus significatifs sont liés au repliement des protéines et au stress du RE (fichier supplémentaire 1 : figure S5), ce qui est cohérent avec ses rôles biologiques connus, et comprend également de nouvelles cibles spécifiques de Th2.

L’intégration des données de ChIPmentation et de RNA-seq révèle les gènes cibles directs de XBP1 et son réseau de régulation. a Diagramme de Venn comparant les gènes cibles de XBP1 précédemment rapportés d’autres types de cellules sécrétoires avec les gènes cibles directs de Th2 de cette étude. Les gènes cibles directs de XBP1 de cette étude sont ceux qui sont communs aux deux catégories  » gènes occupés par XBP1 dans Th2  » et  » gènes exprimés de manière différentielle (Th2 → Th2+4μ8c) « . Les gènes cibles directs de XBP1 des cellules B/plasma, des cellules musculaires squelettiques et des cellules β pancréatiques sont ceux observés par Acosta-Alvear et al. et ont été utilisés ici à des fins de comparaison. b Carte thermique montrant le schéma d’expression des gènes cibles directs de XBP1. Les 38 principaux gènes qui suivent un schéma distinct ont été affichés. c Réseau de régulation transcriptionnelle : facteurs de transcription qui sont des cibles directes de XBP1. Les gènes du réseau sont différentiellement exprimés (régulés vers le haut – rouge ; régulés vers le bas – bleu) vers le haut lors du traitement par 4μ8c. Les facteurs de transcription qui ne sont pas exprimés de manière différentielle mais qui ont un pic ChIPseq de XBP1 sont indiqués dans la liste de droite

Malgré la prépondérance du rôle de XBP1 dans le contrôle de cette voie, d’autres facteurs de transcription s’avèrent également impliqués. Pour examiner la cascade de régulation qui suit la régulation de XBP1, nous avons construit un réseau de régulation transcriptionnelle en extrayant les facteurs de transcription annotés avec des pics ChIP-seq de promoteur ou exonique/intronique (Fig. 5c). La liste complète des facteurs de transcription se trouve dans le fichier additionnel 5 : Tableau S4. Ce réseau a été complété en ajoutant les gènes exprimés de manière différentielle qui ont des interactions annotées avec les facteurs de transcription cibles dans la base de données STRING (fichier supplémentaire 6 : tableau S5).

Les facteurs de transcription qui sont directement régulés par XBP1 peuvent être classés en trois grandes catégories fonctionnelles impliquées dans ce qui suit : résolution du stress du RE sécrétoire des protéines, régulation du cycle cellulaire et de la prolifération, et contrôle de la fonction des cellules immunitaires effectrices. Les facteurs de transcription impliqués dans le stress du RE sont susceptibles de faciliter la sécrétion de cytokines dans les lymphocytes Th2. Cette prédiction est basée sur les rapports précédents concernant les cellules sécrétrices telles que les cellules acineuses du pancréas et les cellules plasmatiques. Ces facteurs de transcription, à savoir Bhlha15, Atf3, Atf6, Atf6b, Atf4 et Creb3l2, se sont avérés être impliqués dans l’adaptation au stress sécrétoire du RE .

Le but des facteurs de transcription liés à la prolifération cellulaire et au cycle cellulaire pourrait être de faciliter l’expansion rapide contrôlée des cellules Th2 activées. Les facteurs liés à la réponse immunitaire sont probablement impliqués dans la différenciation Th2 et la production de cytokines. Par conséquent, nous avons voulu tester l’effet de la downregulation de XBP1s dans la sécrétion de cytokines, la prolifération cellulaire et la production de cytokines.

La voie IRE1a-XBP1 contrôle la sécrétion de cytokines dans les cellules T helper

La comparaison à l’échelle du génome des gènes régulés par XBP1s prédit que le facteur est impliqué dans la sécrétion de cytokines. Pour valider cette prédiction, nous avons bloqué l’activité de l’endonucléase IRE1a dans les cellules Th2 et analysé le surnageant de culture cellulaire pour quantifier le niveau d’IL4 par ELISA. Nous avons choisi l’IL4 comme cytokine candidate testable car son ARNm et sa protéine sont inchangés par la régulation négative de XBP1 (fichier supplémentaire 1 : Figure S6A panneau de gauche, Fig. 6 panneau de gauche et panneau central de la rangée supérieure). Nous avons constaté que la sécrétion d’IL4 est significativement inhibée dans les cellules traitées par la 4μ8c (figure 6, panneau droit de la rangée supérieure). Comme prévu, ce résultat soutient l’implication de la voie IRE1a-XBP1 dans la facilitation de la sécrétion de cytokines dans les cellules Th2, comme prédit. L’inhibition de la voie pendant la phase de restimulation n’a pas d’effet inhibiteur significatif sur la sécrétion d’IL4 (fichier supplémentaire 1 : figure S6B). Ce résultat suggère que la XBP1s est nécessaire pendant la différenciation Th2, peut-être pour le développement d’une machinerie sécrétoire efficace.

La voieIRE1a-XBP1 est nécessaire pour l’expression et la sécrétion de cytokines dans le lymphocyte Th2. Les cellules T helper naïves ont été cultivées après une condition d’activation Th2 en présence de l’inhibiteur IRE1a 4μ8c pendant 3 jours, reposées pendant 2 jours, réactivées par plaque enduite, et analysées par cytométrie en flux pour détecter l’expression intracellulaire des cytokines IL4, IL5 et IL13. Des profils FACS représentatifs sont affichés dans les deux premières colonnes. L’expression intracellulaire des cytokines est comparée dans la troisième colonne, avec trois à sept réplicats biologiques indépendants. Quatrième colonne : les surnageants de culture cellulaire des Th2 traités au 4μ8c ou au DMSO ont été analysés par ELISA pour mesurer la concentration de cytokines. Gating FACS : lymphocytes > singlets > cellules vivantes > cytokines

La voie IRE1a-XBP1 contrôle l’expression des cytokines IL13 et IL5

IL5 et IL13 sont deux cytokines de type 2 proéminentes qui sont impliquées dans l’éosinophilie, les allergies et les infections helminthiques. Nous avons constaté que l’inhibition de la voie IRE1a-XBP1 supprime significativement l’expression et la sécrétion des protéines IL5 et IL13 dans le milieu de culture (Fig. 6 panneaux de droite des rangées du milieu et du bas). L’analyse bioinformatique du transcriptome Th2 prédit que la voie IRE1a-XBP1 contrôle positivement l’expression des gènes IL5 et IL13, car les deux gènes ont été identifiés comme des gènes différentiellement exprimés lors de l’inhibition d’IRE1a (fichier supplémentaire 2 : tableau S1). Nous avons validé cette prédiction par une analyse de l’expression génique médiée par RT-qPCR (fichier supplémentaire 1 : figure S6A, panneau central et droit) et par cytométrie en flux (figure 6). Ces résultats suggèrent une implication transcriptionnelle de la voie régulant IL5 et IL13. Notamment, les niveaux d’ARNm et de protéine de l’IL4 ne sont pas affectés, indiquant une régulation spécifique de l’IL5 et de l’IL13.

La voieIRE1a-XBP1 facilite la prolifération des cellules T helper dépendantes de l’activation

Le taux de prolifération cellulaire est le résultat de l’interaction des régulateurs positifs et négatifs. Nous avons observé que les gènes codant pour les régulateurs positifs et négatifs de la prolifération cellulaire sont différentiellement exprimés lorsque la voie IRE1a-XBP1 a été bloquée par le 4μ8c (figure 7a, panneau de gauche, fichier additionnel 7 : tableau S6), parmi lesquels de nombreux gènes se sont avérés être des cibles directes de XBP1 (figure 7a, panneau de droite, fichier additionnel 8 : tableau S7). Cette observation prédit un changement du taux de prolifération lors de l’inhibition d’IRE1a. Nous avons donc voulu vérifier l’effet de l’inhibition d’IRE1a-XBP1 sur la prolifération cellulaire. Nous avons réalisé un test de prolifération cellulaire en utilisant des cellules Th2. Des cellules T CD4+ spléniques naïves ont été marquées au violet CellTrace et activées dans des conditions de différenciation Th2 en présence ou en l’absence de 4μ8c. La décroissance du colorant fluorescent a été suivie par cytométrie de flux. Nous avons constaté que la régulation négative de XBP1s inhibe la prolifération cellulaire de manière significative (figure 7b), mais n’induit pas la mort cellulaire (fichier supplémentaire 1 : figure S7).

La voieIRE1a-XBP1 favorise la prolifération des cellules Th2 dépendantes de l’activation et le cycle cellulaire. a Panneau de gauche : regroupement hiérarchique des gènes associés à la prolifération cellulaire différentiellement exprimés dans le transcriptome Th2 traité et non traité par le 4μ8c. Panneau de droite : regroupement hiérarchique des gènes cibles directs de XBP1 qui sont connus pour être impliqués dans la prolifération cellulaire. La carte thermique montre les valeurs d’expression mises à l’échelle, désignées par le score Z de la ligne, dans une échelle de couleurs rouge-bleu, le rouge indiquant une augmentation de l’expression et le bleu une diminution de l’expression. b Les cellules auxiliaires T naïves spléniques ont été colorées avec le colorant Violet CellTrace et activées pendant 72 h dans des conditions de différenciation Th2, puis analysées par cytométrie de flux. Les générations de cellules Th2 sont en  » rouge  » et les cellules traitées par le 4μ8c sont en  » bleu  » dans l’histogramme de la prolifération cellulaire (panneau de gauche, une expérience représentative). Représentation graphique de l’indice de division tel qu’obtenu à partir de cinq répétitions biologiques indépendantes (panneau de droite)

La prolifération des cellules T helper est associée à la différenciation et à la production de cytokines. La réduction de l’expression de l’IL5 et de l’IL13 (figure 6) pourrait potentiellement s’expliquer par le fait que la prolifération cellulaire est retardée. Cependant, si la réduction de la prolifération était la raison principale du manque de sécrétion, la production d’IL4 serait également inhibée. Or, nous n’avons observé aucun changement significatif dans l’expression d’IL4 lors de l’inhibition d’IRE1a (Fig. 6, Fichier complémentaire 1 : Figure S6A). Pour examiner cette divergence de manière plus approfondie, nous avons réalisé des tests de prolifération cellulaire en utilisant des lignées de souris rapporteuses IL13-GFP et IL4-GFP. Dans les cellules Th2 exprimant IL4-GFP, nous avons observé une inhibition de la production d’IL4 dans les premières générations de division cellulaire jusqu’à 72 h après le traitement par 4μ8c (fichier supplémentaire 1 : figure S8). Mais à 96 h, la différence d’expression d’IL4 devient insignifiante quelle que soit la génération de division cellulaire dans laquelle se trouvent les cellules. Cette observation suggère que le retard de prolifération dû à l’inhibition d’IRE1a n’est pas suffisant pour inhiber l’expression d’IL4. En revanche, chez IL13-GFP, nous avons observé la diminution de l’expression d’IL13 dès la première génération et cela se poursuit tout au long des générations ultérieures (fichier additionnel 1 : figure S9).

L’inhibition deIRE1a retarde la progression du cycle cellulaire à travers la phase S et G2/M

L’analyse bioinformatique des gènes différentiellement exprimés (Th2 vs Th2 traités par 4μ8c) et des gènes cibles directs de XBP1 révèle plusieurs gènes qui sont impliqués dans le contrôle de la progression du cycle cellulaire à travers différentes étapes (c’est-à-dire, G1, S, G2/M) ont été regroupés en deux groupes régulés à la hausse ou à la baisse (Fig. 8a). Nous avons pris les gènes différentiellement exprimés dans les Th2 traités par le 4μ8c par rapport aux Th2 non traités (valeur p ajustée < 0,05) (Fig. 8a, gauche, fichier additionnel 9 : tableau S8) et les gènes différentiellement exprimés cibles directes de XBP1 (Fig. 8a, droite, fichier additionnel 10 : tableau S9), et nous avons vérifié les rôles connus à travers les étapes distinctes du cycle cellulaire en utilisant soit une liste curée manuellement basée sur les données RNA-seq, soit une base de données publiée . Nous avons constaté que de nombreux gènes de toutes les étapes du cycle cellulaire (c’est-à-dire G1, S et G2/M) étaient affectés. Pour identifier les étapes du cycle cellulaire régulées par la voie IRE1a-XBP1, nous avons créé et utilisé une souche de souris transgénique FUCCI (fluorescent ubiquitin cell cycle indicator) qui exprime la protéine Cdt1 étiquetée mCherry et la protéine Geminin étiquetée mVenus. La souche est similaire à celle utilisée dans . Les cellules G1 sont mCherry+ mVenus- (Q3 ; Fig. 8b), les cellules G1-S sont mCherry+ mVenus+ (Q2 ; Fig. 8b), et les SG2M sont mCherry- mVenus+ (Q1 ; Fig. 8b), tandis que les cellules en mitose et entrant en G1 sont mCherry- mVenus- (Q4 ; Fig. 8b). Nous avons comparé les profils de cycle cellulaire des cellules Th2 traitées par véhicule et par 4μ8c pendant l’activation des cellules T. Nous avons constaté que les cellules s’accumulaient en phase S et/ou G2/M lorsque la voie IRE1a-XBP1 était bloquée (Fig. 8b). Des résultats similaires ont été obtenus dans une approche différente en utilisant le test d’incorporation de BrdU avec coloration DAPI (fichier supplémentaire 1 : figure S10).

L’inhibition deIRE1a retarde la progression du cycle cellulaire à travers la phase S et G2/M. a Panneau de gauche : heatmap des gènes associés au stade du cycle cellulaire différentiellement exprimés dans le transcriptome Th2 traité et non traité par 4μ8c. Panneau de droite : carte thermique des gènes cibles directs de XBP1 qui sont connus pour être impliqués dans le cycle cellulaire. La carte thermique montre les valeurs d’expression mises à l’échelle, désignées par le score Z de la ligne, dans une échelle de couleurs rouge-bleu, le rouge indiquant une augmentation de l’expression et le bleu une diminution de l’expression. b Analyse du cycle cellulaire des lymphocytes Th2 après 72 heures d’activation, en utilisant la lignée de souris FUCCI qui exprime CDT1 marqué par mCherry et GEMININ marqué par Venus. En haut à gauche : représentation schématique des étapes du cycle cellulaire chez la souris FUCCI utilisée. En haut à droite : comparaison des cellules (% du total) obtenues à différents stades du cycle cellulaire chez les Th2 et les Th2 traités par 4μ8c (n = 6). Panneaux inférieurs : un profil FACS représentatif de Th2 et de Th2 traités par 4μ8c montrant des cellules exprimant CDT1 et GEMININ

L’expression transgénique de XBP1s complète l’inhibition de l’activité endonucléase IRE1a médiée par 4μ8c

Pour tester si les phénotypes observés traités par 4μ8c étaient dus à la perte de XBP1s, nous avons réalisé des essais de complémentation en transduisant un vecteur d’expression de XBP1s dans les cellules Th2 in vitro. Le vecteur codait la forme épissée de XBP1 (XBP1s), dont la fonction est indépendante de celle d’IRE1a. Nous avons constaté que l’expression ectopique stable de XBP1s annule l’effet du traitement par le 4μ8c et qu’il n’y a pas de changement significatif du transcriptome lors du traitement par le 4μ8c lorsque les cellules Th2 surexpriment XBP1s (fichier supplémentaire 1 : figure S11A). Les cellules Th2 surexprimant XBP1s prolifèrent et se différencient normalement en présence de 4μ8c (fichier additionnel 1 : figure S11B et S11C respectivement). Ces résultats suggèrent fortement que les phénotypes observés lors du traitement au 4μ8c sont dus à la perte de XBP1s.