Établissement d’un modèle de xénogreffe de cancer gastrique humain chez des souris immunocompétentes en utilisant le microcarrier-6
Abstract
Le cancer gastrique est parmi les tumeurs malignes les plus courantes du tube digestif. L’établissement d’un modèle animal robuste et fiable est le fondement de l’étude de la pathogenèse du cancer. La présente étude a permis d’établir un modèle murin de carcinome gastrique en inoculant des cellules MKN45 à des souris immunocompétentes à l’aide d’un microporteur. Soixante souris mâles C57BL/6 ont été divisées au hasard en trois groupes : un groupe 2D, un groupe porteur vide et un groupe 3D, selon le système de coculture de MKN45 et du microporteur. Les modèles de souris ont été établis par injection hypodermique. Le temps de développement de la tumeur, le taux de formation de la tumeur et les caractéristiques pathologiques ont été observés dans chaque groupe. Dans le groupe 3D, le temps de tumorigenèse était court, tandis que le taux de formation de tumeurs était élevé (75 %). Il n’y a pas eu de formation de tumeur détectable dans le groupe 2D ou le groupe porteur vide. La coloration H&E et immunohistochimique de la xénogreffe de tumeur a montré des signes caractéristiques de néoplasmes gastriques humains. La présente étude a établi avec succès un modèle de carcinome gastrique humain chez des souris immunocompétentes, ce qui fournit un modèle animal nouveau et précieux pour la recherche sur le cancer et le développement de médicaments anticancéreux.
1. Introduction
Avec environ un million de nouveaux cas diagnostiqués chaque année, le cancer gastrique constitue une menace sérieuse pour la santé et la vie des gens dans le monde entier . Cependant, la pathogenèse et les mécanismes de métastase du cancer gastrique n’ont pas encore été complètement clarifiés. Les modèles in vivo de cancer gastrique sont des outils essentiels pour explorer les caractéristiques biologiques de ce cancer et les nouvelles options thérapeutiques potentielles. Des modèles de xénogreffes de cancer gastrique d’origine humaine ont été établis chez des souris immunodéficientes, telles que les souris nude et les souris présentant une immunodéficience combinée sévère. Cependant, les souris immunodéficientes ne sont pas faciles à élever et sont coûteuses. De plus, les souris immunodéficientes ne reflètent pas les rôles importants du système immunitaire dans le développement et la progression des tumeurs. L’établissement d’un nouveau modèle de xénogreffe de cancer gastrique humain chez des souris dotées d’un système immunitaire normal revêt donc une grande importance. Dans la présente étude, MKN45, les cellules cancéreuses gastriques humaines et le microporteur ont été coculturés, et les souris immunocompétentes ont ensuite été inoculées avec la suspension, établissant avec succès une nouvelle xénogreffe de cancer gastrique d’origine humaine.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Matériaux
Milieu de culture du Roswell Park Memorial Institute- (RPMI-) 1640, trypsine, sérum bovin fœtal et pénicilline ont été achetés chez Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les anticorps monoclonaux de lapin anti-humain carbohydrate antigen 199 (CA199), cytokératine 7 (CK-7), et caudal type homeobox 2 (CDX-2) ont été achetés chez Abcam (Cambridge, UK). Le microcarrier-6 a été acheté auprès d’Elyon Biotechnologies LLC (Gaithersburg, MD, USA).
2.2. Animaux expérimentaux
Sixante souris C57BL/6 mâles âgées de 6 à 8 semaines et pesant de 22 à 25 g ont été achetées auprès de Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. (numéro de licence : SCXK 20140007, province de Shandong, Chine) et hébergées dans un centre d’élevage spécifique exempt de pathogènes à l’hôpital affilié du Jining Medical College (province de Shandong, Chine). Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées avec l’approbation du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital affilié de l’Université médicale de Jining et réalisées conformément aux directives approuvées.
2.3. Lignées cellulaires
La lignée cellulaire de cancer gastrique humain MKN45 a été achetée à la banque de cellules de l’Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine) et cultivée dans un milieu RPMI-1640 contenant 10% de sérum bovin fœtal et 100 U/mL de pénicilline à 37°C avec 5% de CO2. Le milieu de culture a été changé toutes les 24 h, et les cellules récoltées par digestion avec de la trypsine à 0,25 %.
2.4. Établissement d’un modèle de culture de cellules tumorales en trois dimensions (3D)
Le microporteur-6 a été trempé dans de l’éthanol à 75 % pendant 24 h, lavé trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate 1x, et incubé dans un milieu RPMI-1640 pendant 24 h. Ensuite, le microporteur-6 a été modifié via une incubation de 3 h avec le stromal cell-derived factor-1 alpha (SDF-1α) et le vascular endothelial growth factor (VEGF), tous deux à une concentration de 100 ng/mL. Les cellules en phase de croissance logarithmique ont été comptées après coloration au bleu trypan et ajustées à une concentration de lorsque la viabilité était >95%. La suspension cellulaire MKN45 a été mélangée avec le microporteur-6 modifié et incubée à 37°C avec 5% de CO2 pendant 24 h supplémentaires pour saturer les cellules avec le microporteur, comme observé par microscopie (Figures 1(c) et 1(d)).
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2.5. Groupement des animaux
Les 60 souris C57BL/6 ont été divisées au hasard en trois groupes (20 souris par groupe) : le groupe bidimensionnel (2D) (animaux inoculés avec contenant ), le groupe porteur vide (animaux inoculés avec contenant 30 μg de microporteur-6), et le groupe 3D (animaux inoculés avec contenant et 30 μg de microporteur-6).
2.6. Génération du modèle animal
Le modèle de culture de cellules tumorales 3D a été établi le premier jour de l’expérience et incubé pendant 24 h. Le deuxième jour, les complexes cellules-microporteur cultivés ont été lavés trois fois dans et mélangés doucement avec pour ajuster la concentration aux cellules et 300 μg de microporteur-6 par 1 mL de suspension, et placés sur la glace pour une utilisation ultérieure. Les cellules MKN45 en phase de croissance logarithmique ont été récoltées, trypsinées, lavées trois fois avec , et remises en suspension dans à une concentration de , qui a été placée sur la glace pour une utilisation ultérieure. Le microporteur-6 modifié a été lavé trois fois avec , remis en suspension dans à une concentration de 300 μg/mL, et placé sur la glace pour une utilisation ultérieure. Chaque souris des trois groupes expérimentaux a été inoculée avec 100 μL de la solution correspondante sous la crête axillaire droite.
2.7. Détection des indicateurs et examen pathologique
Après l’inoculation, les souris ont été logées séparément par groupe, et l’appétit, les activités et le poids quotidiens ont été surveillés. Le temps de formation de la tumeur locale et le volume de la tumeur chez chaque souris ont été enregistrés. Une fois les tumeurs visibles, le diamètre long (a) et le diamètre court (b) de chaque tumeur ont été mesurés quotidiennement, et le volume de la tumeur a été calculé selon la formule du volume tumoral : . Les souris porteuses de tumeurs ont été sacrifiées en trois lots : 10, 20 et 30 jours après l’inoculation. Les tissus tumoraux ont été complètement retirés de chaque souris, et la qualité, la texture et le degré d’infiltration et de nécrose de la tumeur ont été enregistrés. Les tissus tumoraux ont ensuite été fixés dans du formaldéhyde tamponné neutre à 4 % et colorés à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E). La technique de coloration en deux étapes EnVision a été utilisée pour l’immunohistochimie. Les résultats de la coloration ont été déterminés en fonction de la coloration cytoplasmique granulaire positive de la tumeur. Une coloration négative (-ve) était définie comme <5% de cellules colorées positivement, et une coloration positive (+ve) était définie comme ≥5% de cellules colorées positivement.
2.8. Analyse statistique
Le logiciel SPSS 13.0 (IBM SPSS, Chicago, IL, USA) a été utilisé pour l’analyse statistique. Les données de mesure sont présentées sous forme de moyennes ± l’erreur standard de la moyenne (SEM). Les différences entre les valeurs moyennes de chaque groupe ont été comparées à l’aide d’une analyse de variance à sens unique (ANOVA) ou du test de Kruskal-Wallis, selon le cas. est considérée comme une différence statistiquement significative.
3. Résultats
3.1. Établissement du système de culture tumorale 3D MKN45 in vitro à l’aide du microcarrier-6
Le microcarrier-6 est un nouveau microcarrier composé de polymères organiques positivement électrifiables avec une structure poreuse multicouche. La taille des pores, la densité de charge de surface positive et la taille du microporteur-6 peuvent être ajustées par synthèse chimique. Le microporteur-6 de type C, qui présente un petit volume, des pores de grande taille et un pliage spatial multiple, est principalement utilisé pour la culture cellulaire en 3D et les expériences de sensibilité aux médicaments (figures 2(a) et 2(b)). Le microporteur-6 de type M, de grand volume, de petite taille de pore et à faible temps de pliage interne, est principalement utilisé pour la recherche en ingénierie tissulaire (Figures 2(c) et 2(d)). Le microporteur-6 de type C a été utilisé dans notre étude. Le microporteur-6 est un composé organique pur qui n’est pas sujet à la contamination, ne contient pas d’impuretés, est peu immunogène et métabolique, et est hautement biocompatible, fournissant un microenvironnement stable pour la croissance cellulaire (Figures 2(a)-2(d)). En outre, le microporteur-6 est directement intégré dans la peau des souris, ce qui induit la croissance des vaisseaux sanguins (figures 2(e) et 2(f)), qui peuvent fournir un apport sanguin suffisant pour la croissance des cellules tumorales. Les cellules MKN45 ont rapidement adhéré à l’environnement 2D, et la morphologie cellulaire observée au microscope après 24 heures de culture présentait une forme de polygone irrégulier (Figure 1(a)). Le microporteur-6 présentait une forme irrégulière ou en fuseau long et une texture lâche (Figure 1(b)). Après une coculture de 24 heures de MKN45 et du microporteur-6 modifié, les cellules MKN45 ont bien adhéré au microporteur et ont atteint la confluence. De plus, des amas cellulaires irréguliers ont été observés autour des cellules MKN45 adhérant au microporteur-6 (Figure 1(c)). Les complexes cellules MKN45-microporteur ont été colorés avec une solution de 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), révélant un grand nombre de cellules MKN45 adhérant à l’échafaudage du microporteur-6 (Figure 1(d)). La structure poreuse multicouche des microporteurs peut être observée au microscope électronique à balayage (Figure 1(e)). Les cellules MKN45 ont adhéré aux microporteurs, et les cellules adhérant à la surface ont formé des amas cellulaires (Figure 1(f)).
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3.2. Survie des souris et formation de tumeurs
Aucune modification significative de l’appétit, du pelage ou du poids corporel n’a été notée entre les groupes au cours de l’expérience (tableau 1). Les souris du groupe 3D ont montré une légère diminution de leur activité une semaine après l’inoculation. Aucun animal n’est mort dans aucun groupe, et aucune formation de tumeur n’a été constatée dans les groupes porteur vide ou 2D pendant l’expérience de 30 jours. Des masses sous-cutanées ont été identifiées par palpation chez 15 des 20 souris du groupe 3D 7 à 10 jours après l’inoculation, ce qui suggère un taux de formation de tumeurs de 75 % (tableau 1). Les xénogreffes tumorales se sont développées rapidement et ont été observées sous forme de masses sous-cutanées environ 10 jours après l’inoculation (figure 3(a), figure supplémentaire 3). Les xénogreffes tumorales ont atteint une taille de 0,5-1,0 cm3 entre 2 et 3 semaines après l’inoculation. Les tissus des xénogreffes tumorales étaient facilement séparés des tissus adjacents et présentaient des formes relativement régulières, le plus souvent rondes ou ovales, de couleur blanc grisâtre ou rouge grisâtre, avec un apport sanguin périphérique abondant (figures 3(b) et 3(c) et figure supplémentaire 3). Des modifications histologiques du site d’injection ont été observées dans le groupe porteur vide, mais aucune modification dans le groupe 2D (Figures 3(d) et 3(e)). De petites masses sous-cutanées ont été observées avec une couleur jaune dans le groupe porteur vide (Figure 3(d)).
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3.3. Coloration H&E
L’histomorphologie, observée par microscopie optique, a montré un grand nombre de cellules désordonnées et atypiques dans les xénogreffes tumorales des souris du groupe 3D (Figures 4(a)-4(c)). Un grand nombre de cellules hétérotypiques, de microporteurs résiduels et de vaisseaux sanguins abondants ont été observés 10 jours après l’inoculation (figure 4(a)). Un petit nombre de microporteurs résiduels (Figure 4(b)) et un grand nombre de lésions nécrotiques (Figure 4(d)) ont été observés 20 jours après l’inoculation. Cependant, les microporteurs ont été substantiellement éliminés 30 jours après l’inoculation (Figure 4(c)). Un grand nombre de microporteurs et un petit nombre de cellules inflammatoires ont été observés dans le groupe de porteurs vides, mais aucune cellule tumorale n’a été trouvée (Figure 4(e)).
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3.4. Immunohistochimie
L’immunohistochimie a été réalisée chez les animaux euthanasiés 20 jours après la xénogreffe de tumeur. Les tissus de la xénogreffe tumorale ont montré une coloration positive de CA199, CK-7 et CDX-2 (Figures 4(f)-4(h)), confirmant encore que les cellules atypiques étaient des cellules tumorales d’origine humaine.
4. Discussion
Les modèles animaux ont été largement utilisés pour étudier la pathogenèse et les mécanismes métastatiques du cancer gastrique et jouent un rôle extrêmement important dans l’évaluation de l’efficacité et de la toxicité des médicaments thérapeutiques . À l’heure actuelle, les modèles animaux de cancer gastrique sont principalement les suivants : le modèle d’induction, le modèle de transplantation et le modèle de génie génétique. Parmi ces trois types de modèles, le modèle de transplantation est facile à mettre en œuvre et donc largement utilisé. Le type d’animaux expérimentaux, les xénogreffes de tumeurs, ainsi que le site et la voie de transplantation sont considérés comme des facteurs qui affectent le succès des modèles de xénogreffes. Les souris présentant des défauts dans la fonction immunitaire, comme les souris nude et les souris souffrant d’immunodéficience combinée sévère (SCID), sont couramment utilisées pour les modèles de xénogreffe. Cependant, en raison du coût relativement élevé, de la courte durée de vie et de l’absence de réponse immunitaire aux tumeurs chez les souris immunodéficientes, nous avons choisi des souris C57BL/6 immunocompétentes pour le modèle de xénogreffe afin d’éviter les inconvénients des souris immunodéficientes. On pense généralement que l’apparition du cancer gastrique n’est pas liée au niveau d’œstrogène, et que l’incidence du cancer gastrique est plus élevée chez les mâles que chez les femelles. Nous avons donc utilisé des souris mâles comme modèles. En outre, la présente étude a utilisé des cellules cancéreuses gastriques humaines MKN45 pour établir le modèle in vitro, principalement en raison des fortes caractéristiques invasives et métastatiques de cette lignée cellulaire. En outre, la région sous-cutanée de l’aisselle et la transplantation ectopique ont été choisies comme site et voie de transplantation des cellules tumorales, respectivement, en raison de l’approvisionnement abondant en sang et de la structure lâche des tissus de cette zone, ce qui facilite la croissance des tumeurs chez les souris .
En tant que pont entre le système de culture cellulaire 2D et le modèle animal, le système de culture cellulaire 3D simule mieux le microenvironnement de la croissance des cellules tumorales et est devenu un sujet attrayant dans la recherche actuelle . La culture en 3D de cellules cancéreuses permet de former des organoïdes tumoraux, et des modèles de xénogreffes de tumeurs de souris basés sur des organoïdes tumoraux ont commencé à être appliqués au dépistage de médicaments anticancéreux. La présente étude a utilisé les nouvelles cellules microcarrier-6 et MKN45 pour les expériences de coculture afin d’établir avec succès un modèle de croissance en 3D. Nous avons directement intégré le microporteur-6 dans le tissu sous-cutané des souris pour permettre aux vaisseaux sanguins de pénétrer dans les microporteurs, ce qui présente un avantage spécifique qui n’est pas obtenu avec d’autres microporteurs. Des études ont fait état d’une légère immunosuppression de souris immunocompétentes pour obtenir une résistance aux cellules tumorales humaines, ce qui a permis d’établir avec succès un modèle de souris porteuse de tumeur ; cependant, à ce jour, il n’existe aucun rapport sur la transplantation ectopique réussie d’une tumeur humaine chez des souris normales dans des conditions non immunosuppressives. En outre, lorsque nous avons ajusté la concentration de cellules MKN45 à et injecté immédiatement 100 μL de suspension de cellules MKN45 par voie sous-cutanée à chaque souris, la formation d’une tumeur stable n’a pas été obtenue en raison de la forte clairance immunitaire des cellules tumorales humaines transplantées ectopiquement. Le microporteur-6 utilisé dans la présente étude présentait une faible immunogénicité et une texture lâche avec de nombreux pores au centre, facilitant la croissance des cellules tumorales. Le microporteur-6 a également agi comme une barrière pour empêcher les cellules immunitaires de tuer directement les cellules tumorales. Le microporteur-6 modifié a permis aux vaisseaux sanguins de se développer facilement à l’intérieur de la tumeur, fournissant des conditions propices à la croissance rapide des cellules tumorales.
L’immunité cellulaire est la principale armée contre la croissance tumorale ; les cellules impliquées comprennent principalement les cellules T, les cellules tueuses naturelles, les macrophages et les cellules dendritiques . En raison de la structure irrégulière en forme de « labyrinthe » du microporteur-6, il peut agir comme une barrière à court terme et bloquer dans une certaine mesure la destruction directe des cellules tumorales par les cellules immunitaires. En outre, trois heures avant l’expérience, le microporteur-6 a été modifié avec du SDF-1α et du VEGF pour accélérer la formation de vaisseaux sanguins et fournir un approvisionnement en sang pour une croissance rapide de la tumeur, ce qui a dépassé l’effet immunitaire antitumoral des souris. Simultanément, nous avons constaté que les macrophages dans le sang périphérique et les tissus spléniques des souris étaient significativement diminués pendant le stade précoce de la formation de la tumeur transplantée, par rapport au groupe témoin normal (figure supplémentaire 1). Le nombre de macrophages de la moelle osseuse a progressivement diminué entre le groupe porteur vide, le groupe 2D et le groupe 3D, mais il n’y avait pas de signification statistique (figures supplémentaires 2A, 2B). Par rapport au groupe porteur vide, le nombre de lymphocytes T de la rate dans le groupe 2D a diminué, mais sans signification statistique (figure supplémentaire 2C). Le nombre de lymphocytes T de la rate dans le groupe 3D était significativement inférieur à celui du groupe 2D (figure supplémentaire 2C). Cela suggère que la croissance de la tumeur a inhibé le système immunitaire, permettant à la tumeur de se développer rapidement.
La présente étude a établi un modèle de croissance 3D de cellules MKN45, établissant avec succès un modèle de xénogreffe de cancer gastrique humain chez des souris immunocompétentes dans le groupe 3D, alors que les souris des groupes 2D et porteur vide n’ont formé aucune tumeur. Ce modèle de xénogreffe était caractérisé par la croissance rapide des tumeurs, qui pouvaient être palpées à la main 7 à 10 jours après l’inoculation et qui ont atteint une croissance optimale 10 à 15 jours après l’inoculation ; le volume de la tumeur était de 0,5 à 1,0 cm3 environ 20 jours après l’inoculation. Une coloration H&E a permis de détecter un grand nombre de cellules avec des atypies nucléaires qui avaient infiltré les tissus musculaires et adipeux. Le microcarrier-6 résiduel était entouré de cellules inflammatoires et formait des granulomes avec une grande zone de nécrose au centre, ce qui était probablement dû à un apport sanguin insuffisant en raison de la croissance rapide de la tumeur. Ces phénomènes sont cohérents avec le développement de tumeurs chez l’homme. De plus, les capillaires abondants étaient principalement situés à la périphérie des tumeurs. À l’heure actuelle, il n’existe pas de marqueur tumoral spécifique pour le cancer gastrique ; cependant, CA199, CK-7 et CDX-2 sont couramment utilisés comme marqueurs des tumeurs gastro-intestinales. Nous avons donc choisi ces trois marqueurs pour le marquage et l’identification des cellules cancéreuses gastriques d’origine humaine. La coloration immunohistochimique de CA199, CK-7 et CDX-2 était positive, confirmant encore que les cellules hétéromorphes étaient des cellules cancéreuses gastriques humaines.
5. Conclusions
Nous avons établi avec succès un modèle de xénogreffe de cancer gastrique humain chez des souris immunocompétentes. Ce modèle peut refléter l’interaction entre le système immunitaire du corps et les tumeurs et a de larges perspectives d’application dans la recherche future sur l’immunité des tumeurs ainsi que la recherche et le développement de nouveaux médicaments .
Data Availability
Les données utilisées pour soutenir les résultats de cette étude sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande.
Conflits d’intérêts
Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts.
Contributions des auteurs
Yanzhen Bi, Quanyi Wang et Yonghong Yang ont contribué à parts égales à ce travail.
Remerciements
Cette étude a été soutenue par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81170395 et 81570556), de la Fondation des sciences naturelles de la province de Jilin (20180101137JC et 20180101130JC), et du Fonds de recherche pour le poste d’académicien de Lin He de la nouvelle médecine et de la traduction clinique à l’Université de médecine de Jining (JYHL2019FMS21).
Matériaux supplémentaires
Les changements de cellules inflammatoires et d’autres données tumorigènes. Figure supplémentaire 1 : les changements des cellules inflammatoires chez les souris porteuses de tumeurs pendant le stade précoce de la formation de la tumeur transplantée. Figure supplémentaire 2 : changements des cellules inflammatoires dans différents groupes au cours de la phase précoce de la formation de la tumeur transplantée. Figure supplémentaire 3 : souris porteuses de tumeurs et tissus tumoraux transplantés. (Matériaux supplémentaires)