3.06.4.1.1 Levadura Saccharomyces

Los primeros estudios habían demostrado que la levadura Saccharomyces puede fermentar la xilulosa a etanol, aunque no de forma eficiente. Así, teóricamente, la levadura Saccharomyces sólo carece de la(s) enzima(s) para convertir la xilosa en xilulosa. Como se ha descrito anteriormente, las bacterias convierten la xilosa en xilulosa con una sola enzima que no requiere cofactores (Figura 3). Por el contrario, el sistema de xilosa a xilulosa de las levaduras requería dos enzimas que no son metabólicamente ideales, como se ha descrito anteriormente. Inicialmente, casi 10 laboratorios diferentes de todo el mundo intentaron clonar un gen de xilosa isomerasa bacteriana en la levadura. Ho et al. de la Universidad de Purdue fueron el primer grupo que logró clonar el gen de la xilosa isomerasa de Escherichia coli. Sin embargo, la proteína sintetizada en la levadura por el gen bacteriano clonado no tenía actividad xilosa isomerasa.

Un segundo enfoque fue clonar los genes XR y XD de P. stipitis en la levadura Saccharomyces. Sin embargo, la cinética de estas enzimas y el equilibrio termodinámico de la reacción favorecen la producción de xilitol en lugar de etanol. A principios de los años 90, tres grupos (Kotter, Ciriacy y sus colegas de la Universidad de Düsseldorf, Tantirungkij y sus colegas de la Universidad de Osaka, y Hahn-Hägerdal y sus colegas de la Universidad de Lund) informaron del éxito de la clonación de los genes XR y XD en la levadura Saccharomyces para hacerla capaz de fermentar la xilosa. Sin embargo, la levadura recombinante desarrollada por estos grupos fermentaba la xilosa con extrema lentitud y producía poco etanol; el principal producto metabólico era el xilitol.

El grupo de Ho planteó la hipótesis de que la sobreexpresión de la xiluloquinasa nativa (XK) junto con la XR y la XD de P. stipitis mejoraría el flujo de xilosa a través del metabolismo hacia el etanol al reducir la concentración intracelular de xilulosa. Como la xilulokinasa cataliza una reacción irreversible hacia la producción de etanol (Figura 3), una alta actividad de la xilulokinasa resultará en bajas concentraciones de xilulosa. Esto es deseable porque el equilibrio de la reacción catalizada por la XD favorece el xilitol, y se necesitan bajas concentraciones de xilulosa en estado estacionario para dirigir el flujo metabólico en la dirección de la producción de etanol. Además, la clonación de estos tres genes permitió controlar su expresión en la célula. Bajo el sistema de control de expresión nativo de la célula, su expresión es inducida por la presencia de xilosa y es inhibida por la glucosa. La levadura recombinante resultante podría ser capaz de cofermentar la glucosa y la xilosa simultáneamente en etanol sin el largo período de retraso entre la fermentación de la glucosa y la xilosa, lo que sería extremadamente deseable para la producción industrial de etanol.

En 1989, el grupo de Ho en Purdue informó por primera vez de la clonación del gen de la xilulokinasa de la levadura Saccharomyces. Posteriormente, el grupo de Ho sustituyó las secuencias de ADN aguas arriba de los genes estructurales XR, XD y XK por secuencias aguas arriba de los genes glucolíticos que contienen promotores constitutivos eficaces. Los genes XR, XD y XK resultantes se clonaron en un plásmido de alto número de copias 2μ y el plásmido resultante, pLNH32, se utilizó para transformar una cepa de levadura industrial Saccharomyces de tipo salvaje conocida por ser superior para la producción de etanol utilizando almidón (glucosa) como materia prima. En 1993, el mismo grupo informó del desarrollo exitoso de la levadura recombinante Saccharomyces 1400 (pLNH32) que podía fermentar altas concentraciones de xilosa casi por completo a etanol con muy poco xilitol como subproducto. Además, la levadura resultante podía cofermentar la glucosa y la xilosa para obtener etanol sin que existiera un gran período de retraso entre la fermentación de estos dos azúcares, aunque la tasa de fermentación de la xilosa es más lenta que la de la glucosa (Figura 4). Posteriormente, se informó de los detalles de la construcción y desarrollo del 1400 (pLNH 32). Desde entonces, el grupo Ho ha continuado mejorando la levadura con varios enfoques novedosos como se describe a continuación.

Figura 4. (Izquierda) Cepa de levadura Saccharomyces 1400 transformada con el plásmido padre de pLNH32 que no contiene genes XR, XD o XK o que sólo contiene XR y XD, pero no XK, utilizada para fermentar una mezcla de glucosa y xilosa. (Derecha) Levadura 1400 transformada con el plásmido pLNH32, que contiene los genes XR, XD y XK clonados. La levadura se utilizó para fermentar glucosa y xilosa en condiciones idénticas a las descritas en la figura de la izquierda. Los genes clonados en estos plásmidos se modificaron y construyeron de forma idéntica a la descrita en la Referencia 9.

El plásmido 2 μ, pLNH32, que contiene el gen XR-XD-XK clonado es un plásmido huésped amplio diseñado para poder transformar cualquier cepa de levadura Saccharomyces, incluida la levadura Saccharomyces industrial de tipo salvaje. Este plásmido puede utilizarse para seleccionar mejores huéspedes para la producción de etanol celulósico. El grupo de Ho también ha desarrollado una nueva y exclusiva técnica de integración de genes que facilita la integración efectiva de múltiples genes en el cromosoma de la levadura en múltiples copias. Esta técnica es fácil de realizar y casi garantiza que los genes clonados en el plásmido de integración y transformados en las células de levadura huésped puedan integrarse en el genoma huésped en tantas copias como se desee para proporcionar las mejores actividades (Figura 5). Esta técnica de integración se utilizó para desarrollar la cepa 1400 estable que fermenta la xilosa, 1400 (LNH-ST), integrando primero los genes XR-XD-XK juntos como un casete en el cromosoma de la levadura en suficientes copias hasta que la levadura resultante fermentara la xilosa con la mayor eficiencia (Figura 6). La mejor cepa actual desarrollada por el grupo Ho, la 424A (LNH-ST), fue seleccionada a partir de 10 cepas diferentes de levadura Saccharomyces transformando primero cada cepa con el plásmido 2 μ pLNH32 para asegurarse de que estas cepas eran capaces de fermentar la xilosa así como de cofermentar la glucosa/xilosa de forma eficaz en presencia de pLNH32, seguido de la integración de genes en los cromosomas de las cepas de levadura seleccionadas para desarrollar la «levadura estable» mediante esta nueva técnica de integración. La cofermentación de glucosa/xilosa por 424A (LNH-ST) se muestra en la Figura 7.

Figura 5. Demostración de la integración escalonada de múltiples copias de los genes XR-XD-XK en los cromosomas de la cepa de levadura Saccharomyces 259 mediante el método descrito en Ho et al. . Se utilizaron levaduras en diferentes etapas de integración para fermentar glucosa y xilosa en condiciones idénticas para demostrar el progreso de la integración de estos genes: a) En la etapa inicial de integración, b) 25% de finalización, c) 50-75% de finalización, d) después de la finalización de la integración. La finalización de la integración se refleja en que las células del proceso de integración producen los mismos resultados de fermentación durante un periodo de tiempo suficientemente largo.

Figura 6. Co-fermentación de glucosa y xilosa con 1400 (LNH-ST) que contienen múltiples copias de genes XR-XD-XK integrados en los cromosomas de la levadura por el método de Ho et al. .

Figura 7. Co-fermentación de glucosa y xilosa con la cepa 424A (LNH-ST) recombinante de Saccharomyces que contiene múltiples copias de los genes XR-XD-XK integrados en los cromosomas de levadura de la cepa 424A de Saccharomyces por el método de Ho et al. . Se trata de la mejor levadura Ho-Purdue desarrollada en la Universidad de Purdue antes de 2007 y que actualmente se suministra a la industria para la producción de etanol celulósico.

Si se utiliza un microorganismo recombinante para la producción industrial a gran escala, como por ejemplo para la producción de etanol, es necesario integrar los genes que se van a clonar en los cromosomas del huésped por dos razones fundamentales. Una es que si los genes clonados se integran en los cromosomas del huésped mediante un método fiable, los genes clonados pueden mantenerse en el cromosoma del huésped sin requerir el uso de productos químicos, medios, antibióticos y aditivos especiales. El requerimiento de productos químicos o antibióticos para mantener los rasgos no sólo añade el coste de los productos químicos, sino que también añade el coste y la dificultad en el proceso de aprobación reglamentaria y la limpieza de cualquier efluente. Incluso en presencia de un agente selectivo, los plásmidos de alto número de copias, como pLNH32, utilizados para clonar los genes en las células huésped, podrían no ser capaces de sostener una operación industrial a gran escala. El grupo Ho demostró que la levadura estable desarrollada mediante el nuevo sistema de integración, 1400 (LNH-ST), fue capaz de mantener la fermentación continua de hidrolizados de rastrojo de maíz a etanol en una planta piloto, mientras que la misma cepa de levadura que contenía el plásmido, 1400 (pLNH32), no pudo hacerlo.

La cepa 424A (LNH-ST) y otras cepas estables, 1400 (LNH-ST) y 259 (LNH-ST), desarrolladas mediante la nueva técnica de integración, han sido validadas por otros y han demostrado ser sostenibles y eficaces para la producción de etanol celulósico con hidrolizados de diferentes materias primas lignocelulósicas. La cepa 424A (LNH-ST) también se ha utilizado industrialmente para la producción de etanol celulósico a partir de residuos agrícolas en una planta de demostración desde 2004.

La levadura recombinante desarrollada por Hahn-Hägerdal ha sido ampliamente mejorada mediante la clonación de diferentes genes adicionales, incluyendo la clonación del gen de la xilulokinasa después de que el grupo Ho de la Universidad de Purdue demostrara que el aumento de la expresión de este gen nativo mejora el rendimiento del etanol a partir de la xilosa.

La levadura desarrollada por el grupo Ho de Purdue está disponible para la producción industrial de etanol celulósico. Es probable que tenga una buena oportunidad de éxito, ya que es una levadura productora de etanol industrial, y ha sido probada ampliamente. Recientemente, el grupo de Purdue ha seguido mejorando la cepa haciendo que cofermente la arabinosa con los otros cuatro azúcares (glucosa, xilosa, manosa y galactosa), y haciéndola más resistente al etanol y al ácido acético.

Aunque el primer intento de desarrollar una levadura Saccharomyces fermentadora de xilosa basada en la isomerasa no tuvo éxito y se había desarrollado una levadura de ingeniería fermentadora de xilosa efectiva basada en XR/XD, el interés en el desarrollo de una levadura fermentadora de xilosa basada en la isomerasa ha continuado a lo largo de los años, en parte, porque esta vía no tiene un desequilibrio redox. En 2009, Brat et al. construyeron S. cerevisiae fermentadora de xilosa utilizando la xilosa isomerasa de Closteidium phytofermentans. También en 2009, Cargill informó del desarrollo de una cepa de levadura no-Saccharomyces que expresaba xilosa isomerasa y que era capaz de fermentar eficientemente una mezcla de glucosa y xilosa a un pH bajo y en presencia de un 1% de ácido acético.

Aunque la arabinosa sólo está presente en pequeñas cantidades en la biomasa de las hierbas como parte de la hemicelulosa GAX, algunas fuentes especiales de biomasa, como la fibra de maíz, contienen cantidades relativamente grandes de arabinosa. No obstante, lo ideal es que los microbios productores de etanol celulósico sean capaces de fermentar las cinco moléculas de azúcar diferentes presentes en la biomasa celulósica, ya que el reciclaje de los flujos de proceso dentro de un proceso industrial puede aumentar la concentración de componentes menores.

El mecanismo del metabolismo de la arabinosa en los microorganismos es tan complicado como el de la xilosa. De nuevo, el mecanismo del metabolismo de la arabinosa en la levadura es diferente al de las bacterias . Al igual que el metabolismo de la xilosa, el mecanismo metabólico de la levadura no favorece el metabolismo anaeróbico. Recientemente, Hahn-Hägerdal y sus colaboradores han modificado su levadura Saccharomyces fermentadora de xilosa para que cofermente la arabinosa con la xilosa y otros azúcares a través de la vía fúngica de la l-arabinosa. Sin embargo, la levadura modificada resultante seguía siendo incapaz de fermentar la arabinosa hasta obtener una cantidad significativa de etanol, pero era capaz de convertir una pequeña cantidad de arabinosa en arabitol.