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¿Qué es la imagen de campo amplio?

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Introducción

Cualquier técnica de microscopía en la que toda la muestra está expuesta a la luz se conoce como imagen de «campo amplio». La contraparte del campo amplio es el confocal, donde se utilizan agujeros de alfiler para bloquear la mayor parte de la luz hacia y desde la muestra. En este artículo se analizan las imágenes de campo amplio y las técnicas de campo amplio más utilizadas en microscopía.

Microscopios de campo amplio

En el campo amplio, toda la muestra está iluminada por una fuente de luz de lámpara desde abajo (un microscopio vertical) o desde arriba (un microscopio invertido). Los microscopios verticales se utilizan a menudo con muestras fijas, como células o tejidos que han sido tratados y montados en portaobjetos, mientras que los microscopios invertidos suelen ser mejores para obtener imágenes de una muestra sumergida en un líquido, ya que normalmente se hunde en el fondo y es más fácil de ver desde abajo con los objetivos del microscopio. Esto permite obtener imágenes de células en suspensión, ya que las células estudiadas en las ciencias de la vida suelen ser adherentes (crecen adheridas a una superficie) o crecen en suspensión (células suspendidas en un líquido). En la Fig.1 se pueden ver ejemplos de un microscopio vertical e invertido.

Figura 1: Microscopios verticales e invertidos. Izquierda) Microscopio vertical: imagen observada desde arriba e iluminada desde abajo. Derecha) Microscopio invertido: imagen observada desde abajo e iluminada desde arriba. Ambos microscopios también pueden utilizar la iluminación epifluorescente, en la que la fuente de luz y la imagen pasan por los mismos objetivos. La transiluminación incluye técnicas como el contraste de fase y la DIC, que se comentan a continuación. Imagen de Molecular Probes.

Los microscopios de campo amplio suelen utilizar una fuente de luz blanca (como una lámpara) es suficiente con algunos filtros para el trabajo de fluorescencia. Esto también hace que la obtención de imágenes sea más sencilla y el tamaño de los archivos de imagen más pequeño, lo que facilita el trabajo con campo amplio para aplicaciones como la documentación celular.

Técnicas de campo amplio

Ejemplos de técnicas de microscopía de campo amplio son el campo brillante, el contraste de interferencia diferencial (DIC), el contraste de fase y la fluorescencia de campo amplio.

La microscopía de campo brillante es una forma accesible de microscopía, en la que toda una muestra es iluminada por una luz brillante. Este enfoque implica poca preparación de la muestra y puede utilizarse para comprobar rápida y fácilmente las células vivas o para producir datos complementarios. Sin embargo, se recomienda encarecidamente el uso de un agente de contraste, ya que la mayoría de las muestras celulares son transparentes y será difícil resolverlas sin un tinte o colorante. Las células son en su mayoría agua y cuando se obtienen imágenes en vidrio o plástico transparente, puede ser difícil distinguir las estructuras más pequeñas sin algún contraste adicional.

Para el contraste de interferencia diferencial (DIC), la muestra es iluminada por una luz dividida en dos haces de luz polarizados, cuando estos haces se recombinan las diferencias en el cambio de fase aparecen como contraste en la imagen final. Al igual que el contraste de fase, esta técnica no es adecuada para muestras más gruesas y requiere una configuración más técnica que otras técnicas.

La microscopía de contraste de fase proporciona un mejor contraste que el de campo claro al utilizar la luz dispersa de la muestra. Al iluminar la muestra con un anillo de luz y tener otro anillo delante del visor del microscopio, las partes de la muestra que dispersan la luz de forma diferente aparecen como más oscuras o más claras en la imagen, dándole más contraste que la microscopía de campo claro estándar. Este contraste mejorado no se ve en muestras más gruesas, ya que produce artefactos, pero funciona bien con los cultivos celulares. Un ejemplo de estos anillos puede verse en la Fig.2.

Figura 2: La imagen superior muestra un deslizador de microscopio para campo claro y contraste de fase, con el círculo más a la derecha usado para campo claro y los otros dos usados para contraste de fase, dependiendo del aumento (4x y 10/20/40x como se muestra). La imagen inferior muestra muestras obtenidas con DIC o contraste de fase y las diferencias entre estas técnicas. Imágenes adaptadas de Eurotek, Olympus.

La microscopía de fluorescencia de campo amplio es similar a la de campo claro, pero se utilizan longitudes de onda específicas para excitar moléculas fluorescentes con las que se ha tratado previamente la muestra (aunque algunas muestras son naturalmente autofluorescentes). Las muestras pueden teñirse con marcadores fluorescentes para proteínas o componentes celulares específicos, y entonces la luz de emisión de fluorescencia de estos marcadores forma una imagen. La señal de fluorescencia permite obtener un mejor contraste en comparación con otras técnicas, ya que al utilizar longitudes de onda específicas sólo emiten luz las moléculas fluorescentes, en lugar de iluminarse toda la imagen. Sin embargo, como toda la muestra se ilumina usando esta luz, las señales de fluorescencia de fuera del área de visión pueden causar fluorescencia de fondo e imágenes borrosas.

Figura 3: DIC vs contraste de fase vs microscopía de fluorescencia para la misma muestra de neuronas. Izquierda) DIC, las células pueden ser identificadas pero los axones no, el contraste es pobre. Centro) Contraste de fase, mayor contraste que DIC con células y axones fácilmente identificados. Derecha) Fluorescencia de campo amplio, las células y los axones se identifican fácilmente, con proteínas seleccionadas resaltadas en color por marcadores fluorescentes (verde para la β-tubulina, un marcador neuronal, azul para el DAPI, un marcador del núcleo). Imagen de Leica Microsystems: Introduction to Widefield Microscopy.

Luz desenfocada

El principal inconveniente es que, al iluminar toda la muestra, mientras el plano focal recibe luz y puede generar una imagen, los planos situados por encima y por debajo del plano focal también reciben luz, lo que provoca una degradación de la imagen. Especialmente para la excitación de fluorescencia, la resolución de un sistema de campo amplio es limitada debido a que la fluorescencia de fondo también es captada por la cámara y disminuye la relación señal/ruido.

Ciertas técnicas de campo amplio evitan este problema, como la microscopía de iluminación estructurada (SIM), que utiliza patrones de luz para generar un patrón complejo, la obtención de imágenes basadas en la interferencia de patrones permite niveles de detalle de súper-resolución, resolviendo objetos tan pequeños como 200 nm. Puede obtener más información sobre SIM en la nota de la aplicación SIM de nuestro sitio web.

Resumen

La obtención de imágenes de campo amplio es la base de la mayoría de los estudios celulares, ya que permite a los investigadores obtener imágenes de las muestras de forma rápida y sencilla, con un bajo nivel de preparación de las muestras o de conocimientos técnicos. Desde las imágenes de campo claro hasta las de fluorescencia, el campo amplio es una técnica potente y variada con la que muchos investigadores están familiarizados. Aunque la técnica puede carecer de resolución en comparación con la confocal u otras aplicaciones de microscopía avanzada, la obtención de imágenes de campo amplio tiene un lugar firme en la investigación y seguirá desarrollándose con el tiempo.