Abstract

Se recogieron muestras de suero de 474 aves silvestres, 378 caballos y 42 seres humanos con meningitis y meningitis linfocítica entre 2010 y 2014 en diferentes áreas de Polonia. Se detectaron anticuerpos contra el virus del Nilo Occidental (VNO) mediante ensayos inmunoenzimáticos de competición: ELISA-1 ID Screen West Nile Competition, IDvet, ELISA-2 ID Screen West Nile IgM Capture y ELISA-3 Ingezim West Nile Compac. Los anticuerpos se encontraron en 63 (13,29%) de 474 muestras de suero de aves silvestres y en una (0,26%) de 378 muestras de suero de caballos. Catorce (33,33%) de los 42 sueros de pacientes fueron positivos al antígeno del VN y un suero fue dudoso. Las muestras positivas obtenidas en aves se volvieron a analizar con la prueba de microneutralización del virus para confirmar los resultados positivos y las reacciones cruzadas con otros antígenos del complejo de la encefalitis japonesa. Sospechamos que los resultados serológicos positivos en humanos, aves y caballos indican que el VNO puede estar de alguna manera estrechamente relacionado con el ecosistema en Polonia.

1. Introducción

El virus del Nilo Occidental (VNO) puede afectar a una amplia gama de especies de aves, caballos y seres humanos. El virus es un agente emergente responsable de enfermedades en estos animales y en el ser humano en todo el mundo. Los principales vectores del VNO son varias especies de insectos hematófagos, que pueden transmitir el virus a las aves, los caballos y los seres humanos.

Las infecciones se caracterizan por una elevada pirexia, parálisis y morbilidad causada por los factores hasta ahora reconocidos como patógenos sólo para los animales. Más a menudo, las infecciones se caracterizan por signos clínicos leves.

El VNM está en la lista de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) como factor neurotrópico causante de la enfermedad bajo la obligación de notificar. La Fiebre del Nilo Occidental (FNO) causada por el virus es una zoonosis, que es el principal problema de salud pública en EE.UU. .

El VNO es un arbovirus perteneciente a la familia Flaviviridae, género Flavivirus incluido en el complejo antigénico de la encefalitis japonesa inducida por el virus de la encefalitis japonesa (JEV), el virus de la encefalitis de San Luis (SLEV), el virus de la encefalitis del Valle de Murray (MVEV) y el virus Usutu (USUV). El genoma ssRNA+ del virus contiene un único marco de lectura abierto de 11.000 a 12.000 nucleótidos. El genoma del virus consta de siete proteínas no estructurales, NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5, y tres proteínas estructurales: la glicoproteína E, la proteína del núcleo C y la proteína premembrana prM.

Las aves tropicales y migratorias, que pertenecen a diferentes especies, son el principal reservorio del virus. El linaje 1 del VNO es un linaje aislado en todo el mundo, pero el linaje 2 sólo se aisló en África y Madagascar, hasta los brotes húngaros de VNO, que fueron causados por un nuevo linaje 2, que fue introducido en Hungría, muy probablemente por aves migratorias de África, en 2004 . El mismo linaje 2 causó en el verano de 2010 la enfermedad neuroinvasiva endémica (WNND) en humanos en Grecia, con 262 casos confirmados y 35 muertes. En 2011 el virus se extendió al centro de Grecia, pero con menos casos, 101 diagnosticados y 9 fallecidos. El número total de personas infectadas por el virus en Grecia se estima en 18000.

Más de 300 especies de aves diferentes fueron infectadas por el VNO. Por lo general, el virus circula entre las aves silvestres y los mosquitos en ciclo cerrado y puede ser transportado por las aves durante sus migraciones a las diferentes regiones.

El virus está presente en muchos países de todo el mundo y también en 20 países europeos, incluidos los países, que son vecinos cercanos de Polonia, donde se ha confirmado la presencia del virus. También se ha confirmado la presencia de anticuerpos contra el VNO en muestras de suero de aves silvestres y de seres humanos en Polonia.

En 2010, se informó de la morbilidad y la mortalidad humanas causadas por la infección del VNO en Grecia, Rusia, Rumanía, Italia e Israel.También se ha confirmado la circulación del virus Usutu en Polonia. No se han publicado otros estudios sobre la circulación de otros virus responsables del complejo de la encefalitis japonesa en Polonia.

El objetivo del estudio fue la detección de anticuerpos contra el VNO en muestras de suero de diferentes aves silvestres, caballos y pacientes hospitalizados con síntomas neurológicos.

2. Materiales y métodos

Aves. Se tomaron muestras de suero de 474 aves silvestres, 400 cigüeñas blancas (Ciconia ciconia), 21 faisanes comunes (Phasianus colchicus), 19 pinzones comunes (Fringilla coelebs), nueve patos silvestres (Anas platyrhynchos) cuatro águilas de cola blanca (Haliaeetus albicilla), dos urogallos occidentales (Tetrao urogallus), seis palomas mensajeras (Ectopistes migratorius), tres azores del norte (Accipiter gentilis), dos cuervos encapuchados (Corvus cornix), tres azores septentrionales (Accipiter gentilis), y un vencejo común (Apus apus), un mirlo común (Turdus merula), un estornino común (Sturnus vulgaris), un cuervo común (Corvus corax) y un ratonero común (Buteo buteo), fueron recogidos en diferentes lugares de Polonia (Jardines Zoológicos, Centro de Rehabilitación de Animales Protegidos). Sin embargo, la mayoría de las muestras proceden del Centro de Rehabilitación de Aves Silvestres de la Fundación Albatros. Las muestras se han recogido durante marzo-octubre, 2010-2014, cuando la actividad del mosquito era la más alta (Figura 1).

Figura 1

Mapa de Polonia. Zonas donde se recogieron las muestras.

Caballos. Se han obtenido 378 muestras de suero de caballos domésticos sanos de algunos ranchos situados en cuatro distritos. Las muestras de suero se tomaron también de caballos de carreras (Figura 1).

Humanos. Muestras de suero procedentes de 42 pacientes (17 hombres y 25 mujeres) del Departamento de Enfermedades Infecciosas y Neuroinfecciones de la Universidad Médica de Bialystok. Los pacientes presentaban síntomas neurológicos característicos de la meningitis, la meningitis linfocítica y la encefalitis transmitida por garrapatas. Fueron hospitalizados entre mayo y septiembre de 2010. Todos los pacientes fueron sometidos a pruebas de anticuerpos contra el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas mediante Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemens . Las muestras se conservaron a -20°C.

Todas las muestras examinadas se comprobaron dos veces y se analizaron en condiciones de bioseguridad de nivel 3+.

ELISA-1. El estudio serológico se realizó con una competencia comercial, ELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, Francia), para la detección de anticuerpos del virus del Nilo Occidental contra las proteínas de la envoltura pr-E y pr-M que contienen un epítopo común al virus de la encefalitis japonesa según el protocolo del fabricante. Todas las muestras se examinaron dos veces. Las microplacas se leyeron a 450 nm. El ELISA se validó cuando se calcularon las raciones de unión residual (S/N%). Las muestras de suero con raciones S/N iguales o inferiores al 40% se consideraron positivas; las muestras con raciones superiores al 50% se consideraron negativas. Los valores de S/N entre el 40% y el 50% se consideraron dudosos.

ElISA-2 se realizó utilizando ID Screen West Nile IgM Capture (Innovative Diagnostics, Montpelier, Francia). Los pocillos se recubrieron con el anticuerpo policlonal IgM. Cuando se obtenían resultados positivos, la presencia de anticuerpos aparecía como una solución azul y tras la adición la solución de parada se volvía amarilla. En ausencia de anticuerpos, no aparecía ninguna coloración. Las placas se leyeron a 450 nm.

ElISA-3 se realizó utilizando el ensayo enzimático Ingezim WNV Compac (Ingenasa, España) basado en el ELISA de bloqueo, en el que se utilizó un anticuerpo monoclonal (MAb) específico de la proteína E del VNO. Si los anticuerpos estaban presentes en las muestras de suero, se unían al antígeno. Cuando se añadía el MAb específico de la proteína E, éste se unía al antígeno que no era bloqueado por los anticuerpos de la muestra de suero. En caso de que los anticuerpos bloquearan el antígeno, el conjugado no se unió a él. El ensayo se leyó mediante una reacción colorimétrica tras la adición del sustrato. Las muestras se consideraron positivas cuando los valores de DO eran iguales o inferiores a los de las muestras de suero de control positivo. Las muestras se consideraron negativas cuando el valor de DO era igual o superior al punto de corte negativo. Las muestras con valor de DO en el rango de ambos valores se consideraron dudosas.

Prueba de microneutralización del virus. La prueba de microneutralización del virus con muestras positivas a ELISA de aves silvestres se realizó en el Laboratorio Europeo de Referencia, ANSES, Francia. En la prueba se utilizaron células Vero y el virus del Nilo Occidental, cepa IS-98-ST1. La prueba se basó en el procedimiento estándar de la OIE.

3. Resultados

Los distritos de Polonia y las zonas donde se recogieron las muestras se muestran en la figura 1.

La mayoría de las muestras se tomaron de las aves durante la asignación y los tratamientos veterinarios. Algunas de las aves estaban en el centro de rehabilitación después de algunos accidentes. Las aves no manifestaron ningún síntoma de enfermedades neurológicas ni ningún signo de infecciones neurológicas. Cada ave fue suministrada por la organización que envió las muestras con la información sobre la ubicación, el sexo, la edad y, cuando fue posible, sobre el historial de viajes.

Los exámenes de las muestras de suero revelaron anticuerpos específicos contra el VN en 63 muestras de aves silvestres: 62 de cigüeñas blancas y una de pinzón común. Una muestra de suero positiva se obtuvo de una yegua.

En cuanto a las muestras de suero humano, 14 de 42 fueron positivas y una dudosa. Todos los pacientes tenían antecedentes de picaduras de mosquitos y garrapatas. Se diagnosticó encefalitis transmitida por garrapatas en 16 pacientes.

Para confirmar los resultados, se realizó un ELISA-2 para detectar anticuerpos específicos del VNO en suero como primera línea de respuesta inmunitaria. Los resultados fueron negativos y, por lo tanto, no confirmaron la presencia de anticuerpos IgM ni ninguna evidencia de infección reciente de los animales.

Para verificar los resultados obtenidos por ELISA-1, se realizó ELISA-3, y se confirmó la presencia de anticuerpos específicos contra el VNO en estos casos. Los resultados se presentan en la Tabla 1.