Publicado por primera vez el 27 de agosto de 2010

El método de Winkler es el procedimiento más popular para la determinación de la concentración de oxígeno disuelto (OD) en muestras de agua. Sin embargo, este método requiere un volumen de muestra relativamente grande de 200 mL para una determinación precisa del OD. Se han propuesto muchos métodos alternativos para medir las concentraciones de OD en pequeños volúmenes de muestra, pero la mayoría de estos métodos tienen problemas de baja precisión, alto coste, instrumentación complicada o largos tiempos de análisis. En este trabajo se propone una sencilla modificación del método de Winkler para medir las concentraciones de OD en muestras de 1 mL de volumen. El método propuesto es preciso, de bajo coste, sencillo y rápido. Se midieron las concentraciones de OD en 33 muestras tanto con el método de Winkler convencional (WM) como con el método propuesto (PM). Para 23 de las 33 muestras analizadas, la hipótesis de que las medias poblacionales de las mediciones son iguales (μ1 = μ2) no pudo ser rechazada con un nivel de confianza del 95% y para 19 muestras, la hipótesis de que las varianzas poblacionales de las mediciones son iguales (σ21 = σ22)no pudo ser rechazada con un intervalo de confianza del 95%. Por lo tanto, se concluyó que, en la mayoría de los casos, las mediciones de OD por WM y PM dan resultados comparables tanto en términos de exactitud como de precisión.

Introducción

El método de Winkler (Método nº 4500-O-C)1 ha sido aceptado universalmente como un método exacto y fiable2 para la medición de la concentración de oxígeno disuelto (OD) en una variedad de muestras de agua. Este método se considera la referencia para la determinación del OD. Sin embargo, el principal inconveniente de este método es el requisito de un gran volumen de muestra de 200 mL.3

También se han desarrollado numerosos métodos alternativos para la medición del OD. Estos métodos se clasifican en tres categorías distintas, (1) métodos colorimétricos, (2) métodos que utilizan la cromatografía de gases y (3) métodos que utilizan sensores electroquímicos y ópticos. Los métodos colorimétricos pueden utilizarse para determinar el OD en pequeños volúmenes de muestra. Sin embargo, adolecen de inconvenientes como el requerimiento de reactivos químicos caros (por ejemplo, sol de oro) o tóxicos (por ejemplo, cianuro).4 La falta de una justificación adecuada en la selección de la longitud de onda de medición es otro factor limitante de estos métodos.5 La determinación del OD también es posible utilizando la cromatografía de gases. Sin embargo, los métodos de cromatografía de gases, aunque son precisos y requieren pequeños volúmenes de muestras, son sin embargo largos y caros. Los sensores electroquímicos se han utilizado ampliamente para la medición del OD y sus ventajas e inconvenientes se han revisado en otro lugar.6 Los sensores electroquímicos generalmente sufren efectos de presión irreversibles, contaminación por sulfuro de hidrógeno y sensibilidad cruzada.7 También consumen el OD durante la medición y por lo tanto pueden ser inadecuados para volúmenes de muestra muy pequeños. Recientemente se ha prestado atención al desarrollo de sensores ópticos basados en el principio del apagado dinámico de la luminiscencia del oxígeno.8 Estos sensores ópticos son fáciles de usar, tienen un tiempo de respuesta rápido y son duraderos. Sin embargo, todos los sensores, ya sean electroquímicos u ópticos, requieren una calibración según el método de Winkler debido a la sensibilidad de los sensores a la temperatura y la presión.9,10 También son sensibles a la bioincrustación y al crecimiento bacteriano en la superficie del sensor.8

Debido a las limitaciones inherentes de los métodos alternativos descritos anteriormente y a su dependencia del método de Winkler para la comprobación y la calibración, también se han propuesto varias modificaciones del propio método de Winkler para la medición de las concentraciones de OD en volúmenes de muestra de 1-10 mL.11,12,13 Sin embargo, estos métodos de «Micro-Winkler» no son muy populares debido a los complejos requisitos instrumentales y a las elaboradas precauciones necesarias para evitar la contaminación de las muestras a través de intercambios con el oxígeno atmosférico. Estos métodos han sido revisados críticamente en otro lugar.14 Recientemente se ha propuesto un método de valoración gravimétrica Micro-Winkler15 para la medición del OD en muestras pequeñas. Sin embargo, este procedimiento requiere múltiples y precisas mediciones gravimétricas utilizando una balanza sensible y, por lo tanto, parece ser bastante complejo.

En base a la revisión de la literatura, parece que casi todos los métodos desarrollados para las mediciones de DO en muestras pequeñas son deficientes de una manera u otra. Por lo tanto, existe una necesidad constante de desarrollar un método mejor, es decir, exacto, preciso, de bajo coste, sencillo y rápido para la medición del OD en pequeños volúmenes de muestra.

Resumen del método propuesto

El principal desafío en la medición de las concentraciones de OD en pequeñas muestras es la prevención de la contaminación de las muestras a través de la interacción con la atmósfera. Se propone introducir una capa de líquido aislante entre la muestra de agua y la atmósfera. Las propiedades requeridas del líquido aislante son: inmiscibilidad del agua, densidad inferior a la del agua y capacidad de disolución de oxígeno insignificante. Se propone que el líquido aislante se tome en un vial y que la muestra de agua cuya DO se va a determinar (1 mL de volumen) se introduzca directamente debajo de la capa de líquido aislante. La muestra de agua queda efectivamente sellada de la atmósfera mediante este paso. A continuación, la DO de la muestra de agua puede fijarse y convertirse en una cantidad equivalente de yodo utilizando los mismos reactivos que se emplean en el método de Winkler. La solución de yodo se extrae entonces del vial utilizando una jeringa y se valora utilizando Na2S2O3 para determinar la concentración de OD en la muestra.

Después de varias rondas de pruebas, se eligió el n-hexano como líquido aislante, tal como se ha descrito anteriormente. El n-hexano es más ligero que el agua (gravedad específica = 0,7) y es prácticamente inmiscible en el agua. La solubilidad del oxígeno en el n-hexano es de 0,002 fracciones molares,16 es decir, el oxígeno es prácticamente insoluble en el n-hexano.

Material y métodos

Todos los reactivos utilizados eran de grado reactivo analítico (>99% de pureza, Loba Chemicals, India). Se utilizó agua desionizada (Milli-Q, Millipore, EE.UU.) para preparar los reactivos y diluir las muestras. El n-hexano utilizado era de grado HPLC (>99% de pureza, Merck, India). En este estudio se utilizó cristalería de borosilicato. Las soluciones de MnSO4 y álcali-azida-ioduro se prepararon según los métodos estándar (Método nº 4500-O C).1

El procedimiento de medición del OD por el método propuesto (PM) fue el siguiente. Inicialmente, se transfirieron 0,5 mL de n-hexano a un vial de vidrio de 16 mL (Wheaton Science, USA). Luego, se tomó 1 mL de n-hexano en una pipeta de 2 mL, y la pipeta se llenó además con 1 mL de la muestra de agua cuya concentración de DO se iba a determinar. El procedimiento de recogida de muestras anterior garantizaba que la muestra se recogiera sin espacio de cabeza. Este paso de recogida de la muestra es el más crucial, ya que la aparición de cualquier burbuja o espacio de aire en la interfaz hexano-agua o en cualquier otra parte de la pipeta puede dar lugar a errores. A continuación, la boca de la pipeta se colocó por debajo de la capa de hexano en el vial y así se introdujo la muestra por debajo de la capa de hexano, evitando cualquier contacto entre la muestra y la atmósfera. La recogida de la muestra en la pipeta y la aplicación de la muestra por debajo de la capa de hexano en el vial deben realizarse lo más rápidamente posible para minimizar los errores. A continuación, se introdujeron 5 μL de MnSO4 en la muestra de agua por debajo de la capa de hexano utilizando una microjeringa de 10 μL (Hamilton, EE.UU.), seguida de una adición similar de 5 μL de solución de álcali-azida-yodo. La formación del precipitado comenzó inmediatamente después de las adiciones y se completó en 3 min. Después, se añadieron 0,1 mL de H2SO4 conc. con una micropipeta al precipitado formado bajo la capa de hexano. El precipitado se disolvió en 3 minutos y se formó una solución amarilla de yodo debajo de la capa de hexano. Se extrajo exactamente 1 mL de la solución de yodo de debajo de la capa de hexano utilizando una microjeringa y se transfirió a un vaso de precipitados de 25 mL. La solución de yodo de 1 mL en el vaso de precipitados se diluyó a ∼10 mL añadiendo agua desionizada para facilitar la valoración. La adición de agua desionizada simplemente diluye la solución de yodo, sin afectar la cantidad de yodo en el vaso. El contenido del vaso se tituló con una solución de Na2S2O3 0,00625 M. 1 mL de este titulante corresponde a 55,5 mg L-1 de DO en la muestra original. El titulante se tomó en una microjeringa de 250 μL (Hamilton, USA) y se añadió gota a gota al vaso de precipitados con agitación constante hasta que el color amarillo del yodo se descargó casi por completo. A continuación, se añadieron 1-2 gotas de solución de almidón y se continuó la valoración hasta que se descargó el color azul debido al almidón. Con base en el volumen de titulante requerido en una titulación particular, se calculó la concentración de OD en la muestra original.

La concentración de OD también se determinó en varias muestras utilizando el método de Winkler (WM). Los requerimientos de reactivos y otros detalles de ambos métodos se presentan en la Tabla 1.

Resultados y discusión

Se midió la concentración de OD en 33 muestras de agua (véase la Tabla 2) obtenidas de varios lugares de la ciudad de Kanpur, India, y sus alrededores. De las 33 muestras, 8 eran muestras de agua del grifo, 16 eran muestras de agua de río, 6 eran muestras de aguas residuales domésticas diluidas con agua del grifo, 2 eran muestras de agua subterránea y 1 era una muestra de agua de estanque. Las muestras se eligieron de forma que las concentraciones de OD pudieran medirse en una amplia variedad de matrices de muestras. Para cada muestra, se realizaron varias réplicas de las mediciones de OD, tanto por el WM como por el PM. Las medias calculadas de la muestra (), las desviaciones estándar de la muestra (S1, S2) y el número de mediciones replicadas (n1, n2) para WM y PM respectivamente se presentan en la Tabla 2 para cada muestra.

Los gráficos normales de los conjuntos de mediciones replicadas por ambos métodos fueron todos aproximadamente lineales, lo que indica que las mediciones replicadas se distribuyeron normalmente y, por lo tanto, fueron susceptibles de análisis estadístico adicional sobre esa base. A título ilustrativo, en la Fig. 1A se presentan los gráficos normales de cinco mediciones de muestras realizadas por el WM. Los gráficos normales para las mismas cinco muestras realizadas por el PM se presentan en la Fig. 1B.

Las varianzas (S21,S22) en las mediciones replicadas de una muestra por WM y PM respectivamente se utilizaron para la comparación por pares de las varianzas poblacionales correspondientes (σ21,σ22) utilizando la prueba F. De las 33 muestras para las que se midió la DO por los dos métodos (WM y PM), la hipótesis de que las varianzas poblacionales eran iguales (σ21 = σ22) no pudo rechazarse con un nivel de confianza del 95% para 19 muestras. Además, la hipótesis σ21 > σ22 no pudo rechazarse en 4 muestras, mientras que la hipótesis σ21 < σ22 no pudo rechazarse en las 10 muestras restantes, todas ellas con un nivel de confianza del 95%. Estos resultados se han resumido en el cuadro 3.

Además, las varianzas muestrales (S21,S22) y las medias muestrales () de cada muestra, obtenidas por WM y PM respectivamente, se utilizaron para la comparación por pares de las correspondientes medias poblacionales (μ1, μ2). Para las muestras con varianzas iguales (véase el cuadro 3), la comparación por pares se realizó mediante la prueba t de Student. Para las muestras con varianzas desiguales (véase la Tabla 3), la comparación por pares se realizó utilizando la prueba t de varianza desigual.17 En 23 de las 33 muestras en las que las mediciones de OD se realizaron tanto por WM como por PM, la hipótesis de que las medias poblacionales eran iguales (μ1 = μ2) no pudo rechazarse a un nivel de confianza del 95 por ciento.

Las medias muestrales () de cada muestra, obtenidas por WM y PM respectivamente, se trazaron una contra otra en la Fig. 2. Las barras de error mostradas en la figura corresponden a los correspondientes intervalos de confianza del 95%. En la misma figura se dibujó una línea de pendiente unitaria que pasa por el origen. Se observó que todos los puntos estaban muy cerca de la línea de pendiente unitaria, lo que concuerda con las conclusiones generales extraídas en la Tabla 3, es decir, para la mayoría de las muestras, la concentración media de OD obtenida por los dos métodos no es estadísticamente diferente. Por lo tanto, en la mayoría de los casos, la medición de DO por PM fue tan precisa como la medición de DO por WM.

Las desviaciones estándar de las muestras (S1,S2) para cada muestra, obtenidas por WM y PM respectivamente fueron graficadas entre sí en la Fig. 3. En la misma figura se dibujó una línea de pendiente unitaria que pasa por el origen. En este caso, los puntos parecen estar dispersos de manera bastante uniforme con respecto a la línea de pendiente unitaria, con algunos puntos cercanos a la línea, mientras que los otros están más alejados. Estas observaciones también están de acuerdo en general con las conclusiones extraídas de la Tabla 3, es decir, para la mayoría de las muestras, la variación de la concentración de OD medida por los dos métodos no es estadísticamente diferente. Por lo tanto, en la mayoría de los casos, la medición de DO por PM fue tan precisa como la medición de DO por WM.

Se llegó a la conclusión de que con una cuidadosa manipulación de la muestra y titulación, el método propuesto (PM) puede producir resultados comparables al método de Winkler (WM) tanto en términos de exactitud como de precisión. No obstante, la exactitud de la determinación de la DO por PM puede probablemente aumentarse utilizando una microjeringa con un recuento mínimo para la titulación final. La microjeringa utilizada en este estudio tenía un recuento mínimo de 5 μL, lo que corresponde a una incertidumbre de ∼0,25 mg L-1 de OD en las condiciones del presente estudio. Esta incertidumbre puede reducirse utilizando una microjeringa con un recuento mínimo más bajo.

Conclusiones

El objetivo de este estudio fue desarrollar un método preciso, de bajo coste, sencillo y rápido para la medición de DO en pequeños volúmenes de muestra. En base a los resultados y análisis presentados, se puede concluir que el método propuesto resuelve la mayoría de los problemas mencionados. Las principales conclusiones del estudio fueron las siguientes:

➢ La introducción de una capa aislante de n-hexano para la prevención de la transferencia de oxígeno entre la muestra acuosa y la atmósfera da lugar a una determinación consistente y precisa del DO en pequeños volúmenes de muestra. Esta es la principal innovación incorporada en el método propuesto.

➢ También se demostró que, tomando las precauciones adecuadas, el método propuesto (PM) puede producir, en general, resultados estadísticamente comparables con los obtenidos por el método de Winkler (WM), tanto en lo que respecta a la concentración media de OD como a la varianza de la concentración de OD en torno a la media.

➢ Los requisitos de reactivos y material de vidrio para el método propuesto son menores que los del método de Winkler, principalmente debido al menor volumen de muestra utilizado. El n-hexano es el único reactivo adicional utilizado, pero la pequeña cantidad (∼1,5 mL por muestra) de n-hexano requerida tiene un impacto insignificante en el coste global del análisis de la muestra.

Por lo tanto, el método propuesto (PM) puede utilizarse para las mediciones de OD en todas las circunstancias en las que se utiliza actualmente el método de Winkler. El método propuesto es particularmente útil en las circunstancias en las que el método de Winkler no puede utilizarse debido a las limitaciones del volumen de muestra disponible.