Los efectos medidos de Wnt3a en la proliferación de células HEK293T dependen del ensayo aplicado
Abstract
La vía de señalización Wnt se ha asociado a muchos procesos celulares esenciales. Este estudio tiene como objetivo examinar los efectos de la señalización Wnt en la proliferación de células HEK293T cultivadas. Las células se incubaron con Wnt3a, y la activación de la vía Wnt se siguió mediante el análisis del nivel de la proteína β-catenina y de los niveles de expresión de los genes diana MYC y CCND1. El nivel de la proteína β-catenina aumentó hasta cuatro veces. Mientras que los niveles de ARNm de c-Myc y ciclina D1 aumentaron ligeramente, los niveles de proteína se multiplicaron por 1,5. Sorprendentemente, los ensayos MTT y BrdU mostraron resultados diferentes al medir la tasa de proliferación de las células HEK293T estimuladas por Wnt3a. En los ensayos con BrdU se pudo detectar un aumento de la tasa de proliferación, que se correlacionaba con la concentración de Wnt3a aplicada. Por el contrario, esta correlación no pudo demostrarse en los ensayos de MTT. Los resultados del MTT, que se basan en la actividad mitocondrial, se confirmaron mediante el análisis del complejo succinato deshidrogenasa por inmunofluorescencia y por western blotting. En conjunto, nuestro estudio demuestra que Wnt3a activa la proliferación de las células HEK293. Estos efectos pueden detectarse midiendo la síntesis de ADN en lugar de medir los cambios de la actividad mitocondrial.
1. Introducción
Se sabe que la vía de señalización Wnt desempeña un papel clave en la regulación de la diferenciación celular, la proliferación, la supervivencia y la apoptosis . Las proteínas Wnt son una familia altamente conservada de glicoproteínas modificadas con lípidos y ricas en cisteína que activan cascadas de señalización dentro de la célula mediante la unión a un miembro de la familia Frizzled (Fz) de receptores acoplados a proteínas G en la matriz extracelular . Existen 19 miembros de Wnts vertebrados, que pueden agruparse en dos clases principales en función de su capacidad para estabilizar la β-catenina citosólica: vía canónica y vía no canónica. Trabajos recientes también han demostrado que ciertos ligandos Wnt, como Wnt5a, son capaces de activar más de una vía de señalización Wnt , por lo que la clasificación estrictamente binaria está cada vez más desfasada. El mal funcionamiento de la vía de señalización Wnt está relacionado con varias enfermedades como la osteoporosis , la enfermedad de Crohn , la enfermedad de Alzheimer , la esquizofrenia y, especialmente, el cáncer .
El ligando Wnt3a pertenece a la señalización Wnt dependiente de β-catenina (canónica), que se une a los receptores transmembrana frizzled. Posteriormente, el complejo de receptores relacionados con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 5 (LRP5) o LRP6 activa las proteínas citoplásmicas desestructuradas, que desencadenan la inhibición de la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK-3β). La protooncoproteína β-catenina se acumula en el citoplasma como consecuencia del desensamblaje del complejo de destrucción que forman la adenomatosis poliposa coli (APC), la AXIN y la GSK-3β. Así, la β-catenina puede translocarse al núcleo, donde activa la transcripción de genes diana mediada por el factor de transcripción específico de las células T (TCF)/factor de potenciación de los linfocitos (LEF) . Estos genes son responsables de regular procesos fisiológicos esenciales en el desarrollo embrionario y adulto, como la proliferación celular, la diferenciación, la morfogénesis y la adhesión celular.
Con la indicación de la proliferación, existe una compleja interacción entre la señalización Wnt canónica y el ciclo celular. La vía de señalización Wnt/β-catenina es significativa en la estimulación de la progresión de la fase G1 mediante la inhibición de GSK-3β, que regula los efectores del ciclo celular y los reguladores del crecimiento .
Un gen diana directa de la vía de señalización Wnt/β-catenina es el protooncogen MYC, que fue identificado como diana de Wnt en las células de cáncer de colon . El regulador de la transcripción c-Myc controla muchas funciones celulares, especialmente la regulación de la progresión del ciclo celular . El gen codificador de la ciclina D1 CCND1 es también un gen diana de la vía Wnt/β-catenina, que se describió en células de cáncer de colon . La ciclina D1, como activador de la cinasa dependiente de ciclina (cdk) 4 o cdk 6, impulsa la transición de la fase G1/S.
Hay varias formas de medir la proliferación celular inducida por Wnt3a. Un método no radiactivo es un inmunoensayo basado en la incorporación de 5-bromo-2′-deoxiuridina (BrdU) en el ADN para determinar la síntesis de ADN, que se correlaciona con la transición de la fase S y, por tanto, con la proliferación celular . Otro método utiliza la medición de la actividad mitocondrial de las células viables. En el ensayo MTT, las deshidrogenasas mitocondriales producen un producto azul insoluble mediante la reducción del MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio).
En este estudio investigamos la proliferación de las células HEK293T bajo la influencia de los ligandos Wnt3a utilizando el ensayo MTT y el BrdU. Además, comparamos los resultados de estos ensayos con la actividad mitocondrial de las células tratadas con Wnt3a, medida mediante la inmunotinción de la proteína de la cadena de transporte de electrones SDHA (subunidad A del complejo succinato deshidrogenasa).
2. Materiales y métodos
2.1. Células y cultivo celular
Las células de riñón embrionario humano, HEK293T, se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (PAN Biotech, Aidenbach, Alemania), 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma Aldrich, St. Louis, EE.UU.) a 37°C en 5% de CO2.
2.2. Ensayos de proliferación
Se realizaron ensayos de MTT y BrdU en placas de 96 pocillos. Se sembraron diez mil células por pozo y se estimularon las células con dosis crecientes de Wnt3a (R&D Systems, Minneapolis, EE.UU.), a saber, 0, 10, 50, 100, 150 y 200 ng/mL, durante 24, 48 y 72 h. Se disolvió MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) en PBS a 5 mg/mL y se añadieron 20 μL de solución de MTT a cada pozo, seguidos de una incubación de tres horas a 37°C en 5% de CO2. A continuación, se retiró el medio con MTT y se añadieron 200 μL de DMSO. Para disolver los cristales, se agitaron las células durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las placas se leyeron con un lector ELISA (Tecan Group Ltd., Männedorf, Suiza) a 590 nm. Para el ensayo de BrdU se utilizó un kit comercial «Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric» (Roche, Mannheim, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Tras la adición de la solución de marcaje de BrdU, las células se incubaron durante tres horas a 37°C en un 5% de CO2. Tras el último paso de lavado, se añadieron 100 μL/pocillo de solución de sustrato a las células y la reacción se detuvo tras 15 minutos de incubación a temperatura ambiente utilizando ácido sulfúrico. Las placas se leyeron inmediatamente con un lector de ELISA a 450 nm. Todos los ensayos se realizaron por triplicado (). Para la calibración se sembraron células en diferentes números (0,1 × 104 a 3 × 104).
2.3. Inmunocitoquímica y microscopía de fluorescencia
Las células HEK293T se sembraron en placas de 24 pocillos y se trataron con 0-200 ng/mL de Wnt3a a una confluencia del 30% y se fijaron en formaldehído al 4% después de 24, 48 y 72 h. Se añadió el anticuerpo SDHA (Abcam, Cambridge, Reino Unido) a una dilución de 1 : 200 y las células se incubaron durante una hora. Los núcleos celulares se contratinaron con DAPI durante 5 minutos. Las células se analizaron mediante microscopía de fluorescencia (Observer. Z1 de Zeiss, Jena, Alemania) y el software adjunto AxioVision 4.7.
2.4. Electroforesis en gel de proteínas y Western Blot
Se determinaron las concentraciones de proteínas en lisados de células enteras mediante el ensayo de Bradford. Se cargaron cantidades iguales de proteínas en geles de SDS-poliacrilamida (NuPAGE, 4-12%, Life Technologies, Carlsbad, USA). Los geles se ejecutaron a 150 V durante 1 hora y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante el sistema iBlot (Life Technologies). Las membranas se analizaron utilizando anticuerpos primarios contra SDHA, β-catenina, c-Myc, ciclina D1 y β-actina (Cell Signaling, Cambridge, Reino Unido), diluidos 1 : 1000 en TBS-Tween con 3% de leche, seguidos de la incubación con un anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano (dilución 1 : 2000). Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando la detección ECL.
2.5. Aislamiento del ARN y RT-PCR
El ARN total se aisló utilizando NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) y 1 μg de ARN se transcribió inversamente con Verso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania) en un volumen de 40 μL. Las secuencias de los cebadores (MWG, Múnich, Alemania) utilizados para la PCR semicuantitativa con transcriptasa inversa son para GAPDH 5′-catggtgctgagatttgccaac-3′ (hacia adelante) y 5′-tcaaccttgaccttcatcac-3′ (hacia atrás), para MYC 5′-ccgagcaaggacgcactc-3′ (forward) y 5′-gcctttcagagaagcgggtcct-3′ (reverse), y para CCND1 5′-gcctgaacctgaggagcccca-3′ (forward) y 5′-gtcacacttgatcactgg-3′ (reverse). La amplificación de la PCR se realizó con My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Alemania) según el protocolo del fabricante. La reacción se realizó con una desnaturalización preliminar durante 2 min a 94°C, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min, recocido a 55°C (CCND1), 57°C (GAPDH) o 60°C (MYC) durante 30 seg, y extensión a 72°C durante 1 min. El último paso de extensión duró 10 minutos a 72°C. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%.
2.6. Análisis de datos
Se utilizó el software Microsoft Excel para la gestión de los datos, incluido el cálculo de las desviaciones estándar. Los western blots y los geles de agarosa se escanearon mediante el sistema de documentación de geles Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Alemania). Las bandas se cuantificaron mediante el software ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, EE.UU.).
3. Resultados
3.1. Efectos de Wnt3a en la inducción de β-catenina y genes diana típicos de Wnt
Para demostrar la activación de la vía Wnt, detectamos la cantidad de concentración de proteína β-catenina en las células HEK293T tras el tratamiento con Wnt3a (Figura 1). Tras 24 horas de tratamiento, la concentración de proteína β-catenina aumentó con las concentraciones crecientes de Wnt3a. La mayor concentración de proteína β-catenina se identificó a las 24 horas con una concentración de 200 ng/mL de Wnt3a. Aquí la cuantificación mostró un aumento de cuatro veces en comparación con el control. En los puntos de tiempo 48 y 72 horas después del tratamiento el efecto de la inducción de β-catenina ya no es claramente reconocible. Además, analizamos la regulación de los genes diana de Wnt CCND1 y MYC tras el tratamiento con Wnt3a tanto por RT-PCR semicuantitativa como por western blot (Figuras 2 y 3). Se detectó un nivel basal de c-Myc y ciclina D1 en las células no tratadas. Los resultados de la RT-PCR mostraron cambios marginales en la cantidad de cDNA de MYC y una inducción de CCND1 tras 24 y 48 horas con 10 ng/mL de Wnt3a, así como tras 72 h con una concentración de 100-200 ng/mL de Wnt3a. Se observó un ligero aumento del nivel proteico de c-Myc con una concentración de 50 ng/mL después de 24 horas. La cuantificación por western blot de la ciclina D1 mostró un aumento en un factor de 1,5 con una concentración de Wnt3a de 50 a 200 ng/mL después de 24 horas. El nivel proteico de c-Myc ascendió de la misma manera con la concentración de 50 ng/mL de Wnt3a después de 24 horas.
3.2. Ensayos de proliferación celular
Para estudiar los efectos de las proteínas Wnt en el crecimiento celular, se cultivaron células HEK293T en placas de 96 pocillos durante 24 horas antes de ser tratadas con concentraciones de proteína Wnt3a de 0, 10, 50, 100, 150 o 200 ng/mL, respectivamente. Tras 24, 48 y 72 horas de incubación, se realizaron ensayos de MTT y BrdU. Los ensayos de BrdU muestran una tendencia clara; con el aumento de las concentraciones de Wnt3a aumentó la lectura asociada (Figura 4(a)), en la que Wnt3a indica la mayor tasa de crecimiento después de 48 horas y una concentración de 200 ng/mL.
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En contraste con los ensayos BrdU, los ensayos MTT no mostraron una correlación entre las concentraciones de Wnt y el número de células. El número de células se mantuvo casi igual o disminuyó en comparación con sus controles correspondientes (véase la Figura 4(b)).
3.3. Para corroborar aún más el papel de Wnt3a en relación con la actividad mitocondrial en las células HEK293T, se determinaron las cantidades de proteína SDHA mediante western blot, así como mediante análisis inmunocitoquímico. La succinato deshidrogenasa (SDH) con su subunidad SDHA es un componente clave del ciclo del ácido cítrico, que participa en el complejo II de la cadena de transporte de electrones mitocondrial y es responsable de la transferencia de electrones del succinato a la ubiquinona. Las células se trataron de igual manera que los experimentos de análisis de proliferación y se incubaron con el anticuerpo SDHA como se ha descrito anteriormente. Los resultados (Figura 5) mostraron un aumento de la señal de fluorescencia y también una señal más intensa en el western blot en relación con el control después de 24 horas de tratamiento con Wnt3a. Después de 48 horas, el nivel de proteína registrado por microscopía de inmunofluorescencia o por análisis de western blot no mostró ningún cambio significativo. Tras 72 horas de tratamiento con Wnt3a se observó incluso una señal decreciente en ambos experimentos. La señal más alta se midió después de 24 horas con 50 ng/mL de Wnt3a.
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Figura 5
Actividad mitocondrial de las células HEK293T tratadas con Wnt3a. (a) Se expusieron células HEK293T de crecimiento exponencial a diferentes concentraciones de Wnt3a durante los tiempos indicados. Se prepararon extractos de proteínas y se utilizaron para el análisis de western blot. Las fracciones de membrana se incubaron con anticuerpos contra SDHA o, como control de carga, contra β-actina. (b y c) Las células HEK293T se sometieron a un análisis inmunocitoquímico. La proteína SDHA se detectó por fluorescencia verde mediante microscopía de fluorescencia a 200 aumentos. Las barras muestran la intensidad de la banda expresada como porcentaje en comparación con el control no tratado (eje vertical), que se normalizó al 100%.
4. Discusión
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Las proteínas Wnt están implicadas en varias funciones celulares, incluyendo la regulación de la expresión génica para el ciclo celular y la proliferación . Wnt3a es conocido como promotor de la proliferación y migración de las células epiteliales del cristalino humano , también para la proliferación de los fibroblastos o como regulador de la proliferación de las células beta NIT-1 pancreáticas . MYC y CCND1 son genes objetivo de la vía de señalización Wnt en células de mamíferos. Por ejemplo, Yoon et al. expusieron que la señalización Wnt activa la biogénesis mitocondrial realizando un cribado de ARNi a gran escala; identificaron genes que afectan a la función mitocondrial, entre otros MYC .
En este trabajo determinamos los efectos de Wnt3a sobre la proliferación de las células HEK293T. Para ello aplicamos dos ensayos principales, ampliamente utilizados para el análisis de las tasas de proliferación de las células cultivadas, a saber, el ensayo MTT y el ensayo BrdU. De este modo, se detectaron y compararon directamente los efectos específicos de los ligandos Wnt sobre la síntesis de ADN y la actividad mitocondrial.
Para establecer nuestro sistema y probar el efecto de Wnt3a sobre la vía Wnt en las células HEK293T demostramos la inducción de β-catenina tras 24 horas de tratamiento con Wnt3a y analizamos los niveles de expresión de MYC y CCND1. El nivel de ambos genes diana también aumentó tras 24 horas de exposición a Wnt3a. C-Myc tiene un papel clave en la progresión de la fase G1; regula al alza la ciclina D1 y reprime p21 y p27 . A su vez, la ciclina D1 promueve la fosforilación y la inhibición del complejo del retinoblastoma (Rb), que a su vez regula el nivel de ciclina E. El enriquecimiento de la ciclina E conduce a la transición del punto de control de la fase G1/S.
Durante la fase G1 las mitocondrias tienen que suministrar una gran cantidad de energía . A esta fase oxidativa le sigue un periodo reductivo durante la fase S-/G2-/M del ciclo celular, en el que se produce la replicación del ADN y la proliferación de las mitocondrias.
Las tasas de proliferación de los HEK293T tratados con Wnt3a fueron diferentes, cuando se midieron mediante los dos ensayos utilizados en este estudio. Explicamos la diferencia por los mecanismos de detección disímiles de estos métodos. El ensayo MTT mide la actividad de las mitocondrias; por otro lado, el ensayo BrdU detecta la cantidad relativa de ADN recién sintetizado. Wagner et al. hacen referencia a una relación altamente significativa entre el BrdU y el MTT en sus resultados con la proliferación de linfocitos caninos, aunque el ensayo de BrdU resulta ser más sensible que el de MTT . El efecto aparentemente negativo de Wnt3a sobre el número de células podría explicarse por una disminución de la actividad mitocondrial. El ensayo de BrdU, sin embargo, mostró un efecto promotor de la síntesis de ADN en estas células. Los experimentos de la actividad mitocondrial mostraron que sólo después de 24 horas de tratamiento con Wnt3a aumentó el nivel de SDHA. La activación con Wnt3a recombinante no tiene probablemente ningún efecto sobre la actividad mitocondrial después de 48 horas o más. De acuerdo con este efecto limitado en el tiempo es la señal decreciente durante el ensayo MTT después de 48 y 72 horas. Esto también se confirma por la disminución de la acumulación de β-catenina por Wnt3a después de 24 horas. Otras publicaciones apoyan esta suposición de que las células tratadas con Wnt3a indican un aumento del nivel de β-catenina sólo durante un período de 24 horas . Explicamos nuestros resultados, que son contrarios al efecto proliferante publicado de Wnt3a por el hecho de que la mayoría de los estudios utilizaron células sobreexpresadas con Wnt3a, medio condicionado con Wnt3a o células sin suero con proteína Wnt recombinante para la activación de la vía de señalización Wnt/β-actina.
En conclusión, los resultados de los ensayos de BrdU y MTT son difícilmente comparables cuando se miden los efectos de Wnt3a en la tasa de proliferación de las células HEK293T. Las diferencias pueden explicarse por sus diferentes puntos de aplicación, a saber, la actividad mitocondrial y la síntesis de ADN. Para dar pruebas definitivas sobre la tasa de proliferación celular, la interpretación de los resultados de un solo método podría ser engañosa. Para evaluar la proliferación celular, el recuento directo de células mediante métodos ópticos sería el que mejor reflejaría la situación real. Sería interesante comparar los resultados correspondientes con los resultados de los ensayos bioquímicos como el BrdU y el MTT.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este trabajo.
Agradecimiento
Este trabajo fue apoyado financieramente por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF).