En este estudio, para entender el papel de la vía IRE1a-XBP1, nuestra estrategia básica fue utilizar un modelo de diferenciación Th2 in vitro (Fig. 1b). Las células T helper naïve se activaron mediante la activación del TCR en placas recubiertas de anti-CD3e/CD28 en condiciones de diferenciación Th2 durante 72 h, descansaron durante 42 h y se volvieron a estimular mediante la activación del TCR utilizando placas recubiertas de anti-CD3e/CD28. Para perturbar la vía IRE1a-XBP1, utilizamos un fármaco bien establecido 4μ8c que bloquea específicamente la vía mediante la inhibición de la actividad endonucleasa IRE1a . El fármaco se añadió al medio de cultivo a una concentración de 15-μM al inicio del cultivo y durante el paso de la placa de activación a la de reposo. La elección de la concentración del fármaco se determinó por su mayor eficiencia de inhibición de IRE1a con la menor toxicidad celular (archivo adicional 1: Figura S1). Se compararon los transcriptomas de los linfocitos Th2 naïve y reestimulados (tratados con fármacos y no tratados) mediante secuenciación de ARN, se identificaron los sitios de unión del factor de transcripción XBP1 en los Th2 reactivados mediante ChIPmentación (ChIP-secuenciación) y se integraron los datos de todo el genoma para predecir las dianas directas y su función reguladora.

Las células T helper activan la vía IRE1a-XBP1 durante la activación in vitro

Las células T helper activadas y diferenciadas secretan una gran cantidad de citoquinas. Por lo tanto, una maquinaria secretora bien desarrollada es un prerrequisito para que las células se adapten a este estrés secretorio. Para predecir la implicación de la vía del estrés del RE/UPR durante la activación de las células T helper, comparamos el transcriptoma de las células Th2 naïve y diferenciadas (Th2 reestimuladas). Los genes expresados diferencialmente que se obtuvieron de esta comparación se integraron en la vía KEGG «Procesamiento de proteínas en el retículo endoplásmico» para visualizar los componentes que se regulan al alza o a la baja. El análisis muestra que cuando las células T helper naïve se activan y se diferencian en células Th2, regulan al alza la expresión de genes implicados en la vía del estrés del RE (archivo adicional 1: figura S2). Varios factores que se han caracterizado previamente como controladores del plegamiento y la secreción de proteínas, incluido el propio XBP1, se regulan al alza durante la diferenciación de las células T helper.

Para validar esta predicción, e investigar específicamente la implicación de la vía IRE1a-XBP1, medimos la expresión de ARNm y proteínas de IRE1a en linfocitos Th2 diferenciados y reactivados in vitro (Fig. 1b). Las células fueron analizadas por qPCR y Western blot para comparar el mRNA y la proteína respectivamente. Encontramos que tanto el ARNm como el nivel de proteína estaban regulados al alza en las células T helper activadas (Fig. 1c, panel izquierdo y central). Se sabe que la fosforilación de IRE1a denota su estado funcional. Observamos que la proteína está fosforilada en los linfocitos Th2 activados (Fig. 1c, panel derecho). Este aumento de la fosfo-IRE1a puede explicarse por el aumento de la síntesis de la proteína, aunque no podemos excluir la posibilidad de un aumento de la actividad quinasa y de la autofosforilación. El análisis densitométrico de la banda de Western blot sugiere que ambos mecanismos, la regulación al alza de la síntesis de proteínas y el aumento de la fosforilación, están implicados. El aumento de la proteína se triplicó, pero la fosfo-proteína se multiplicó por 4,5 (Fig. 1c).

La IRE1a activada empalma el ARNm XBP1 no empalmado (XBP1u) y produce una isoforma de ARNm XBP1 empalmado (XBP1s). Observamos aumentos en la forma empalmada de XBP1 (XBP1s), tanto a nivel de ARNm como de proteínas, tras la activación de las células T helper (Fig. 1d, e). Se utilizó tunicamicina como control positivo. Se trata de un fármaco que inhibe la glicosilación ligada a N y, por lo tanto, provoca la acumulación de proteínas no plegadas (es decir, el estrés del retículo endoplásmico (RE)), y aumenta las XBP1s al potenciar la actividad de IRE1a. La inhibición específica de la actividad endonucleasa de IRE1a mediante el tratamiento de las células con 4μ8c abolió tanto las isoformas de ARNm como de proteína de XBP1s, confirmando que la formación de la forma empalmada dependía de la actividad de IRE1a (Fig. 1d, e).

Estos resultados confirman que la vía IRE1a-XBP1 se conserva en los linfocitos Th2 y se regula durante la activación in vitro de las células T helper. A continuación, nos propusimos investigar si esto también es válido in vivo.

Los linfocitos T helper activados in vivo regulan al alza la vía IRE1a-XBP1

Para comprobar si la vía IRE1a-XBP1 está operativa en los linfocitos T CD4+ in vivo, infectamos a ratones C57BL/6 con el parásito helminto Nippostrongylus brasiliensis, un modelo bien establecido de respuestas inmunitarias impulsadas por Th2. Tras 7 días después de la infección, analizamos la expresión de la proteína XBP1s en las células T helper mediante citometría de flujo. Encontramos que las células T helper de los ratones infectados por el gusano expresan significativamente más XBP1s en comparación con los ratones de control no infectados, lo que sugiere una regulación al alza de la vía (Fig. 2).

Las células T helper regulan al alza la vía IRE1a-XBP1 in vivo durante la infección. Los esplenocitos de ratones infectados por el nematodo (Nippostrongylus brasiliensis) (7 días después de la infección) se tiñeron con un anticuerpo anti-XBP1s conjugado con PE y se analizaron por citometría de flujo (estrategia de separación: singlete > células vivas > CD4+CD3e+ > XBP1s+). Se muestra un perfil FACS representativo (panel izquierdo), y el gráfico que contiene todos los resultados (n = 4) se muestra en el «panel derecho»

Estos resultados confirman que la vía está activa in vivo. Por lo tanto, nos propusimos diseccionar la vía utilizando enfoques de todo el genoma en linfocitos Th2.

El análisis transcriptómico de todo el genoma de la expresión génica diferencial revela genes regulados por IRE1a-XBP1

Para captar un papel regulador global de genes de la vía IRE1a-XBP1, comparamos células Th2 activadas in vitro con células con actividad de endonucleasa IRE1a inhibida mediante la adición de 4μ8c en los medios de cultivo celular. A continuación, comparamos los transcriptomas de los linfocitos Th2 activados con o sin inhibición de la vía IRE1a-XBP1. Los transcriptomas de las células Th2 tratadas con 4μ8c y no tratadas se obtuvieron mediante secuenciación de ARNm (RNA-seq). El control de calidad de los datos de secuenciación de ARN se muestra en el archivo adicional 1: Figura S3. Al comparar los transcriptomas de los linfocitos Th2 naïve y activados, descubrimos que 10995 genes estaban regulados de forma diferencial tras la activación de Th2. La inhibición de la vía IRE1a-XBP1 mediante el tratamiento con 4μ8c dio lugar a la expresión diferencial de 3144 genes en comparación con el control Th2 no tratado (Fig. 3a, Archivo adicional 1: Figura S3 panel derecho). Dos mil seiscientos setenta de estos genes estaban involucrados en la diferenciación Th2 (Fig. 3a). La agrupación jerárquica de los genes revela los grupos de genes regulados al alza y a la baja tras el tratamiento con 4μ8c (archivo adicional 1: figura S3, derecha). El examen detallado de estos genes reveló que muchos de ellos están asociados con la respuesta a las proteínas no plegadas y el estrés del RE, lo que indica un impacto importante de la vía IRE1a-XBP1 (Fig. 3b) en estos procesos biológicos. La lista completa de genes expresados diferencialmente se encuentra en el archivo adicional 2: Tabla S1. El análisis de Gene Ontology (GO) de estos genes expresados diferencialmente tras el tratamiento con 4μ8c a las células Th2 (es decir, los genes regulados por la vía IRE1a-XBP1) mostró que están enriquecidos en los siguientes procesos biológicos: «Respuesta al estrés del RE» (GO:0006950), «Regulación de la transducción de señales» (GO:0009966), «Producción de citoquinas» (GO:0001816), «Proliferación celular» (GO:0008283), «Ciclo celular» (GO:0007049) y Respuesta inmunitaria (GO:0006955) (Fig. 3c). Estos cambios en los patrones de expresión génica tras la inhibición de IRE1a sugieren una amplia participación del factor de transcripción XBP1 en la activación y proliferación de Th2, así como en la diferenciación. Por lo tanto, nos propusimos encontrar los patrones de ocupación de la cromatina en todo el genoma del factor de transcripción XBP1.

Expresión génica diferencial en Th2 debido a la inhibición de IRE1a-XBP1 por 4μ8c. Se activaron células T helper naïve en condiciones de diferenciación Th2 en presencia o ausencia de 4μ8c. Las células se activaron en placas recubiertas con anticuerpos anti-CD3e y anti-CD28 durante 3 días, descansaron durante 2 días y se reactivaron en placas recubiertas durante 6 h. Los datos de RNAseq se analizaron en busca de la expresión génica diferencial. a Diagrama de Venn que muestra el número de genes expresados diferencialmente en diferentes condiciones experimentales. «Naïve → Th2» indica los genes expresados diferencialmente entre los T helpers naïve y las células Th2. «Th2 → Th2+4μ8c» indica los genes expresados diferencialmente entre las Th2 no tratadas y las tratadas con 4μ8c. b Mapa de calor que muestra los genes expresados diferencialmente que se sabe que están implicados en la resolución del estrés del RE impuesto por la respuesta a las proteínas no plegadas. El mapa de calor muestra los valores de expresión escalados, denotados como puntuación Z de la fila, en una escala de color rojo-azul en la que el rojo indica un aumento de la expresión y el azul una disminución de la misma. c Análisis de ontología genética (GO) de los genes expresados diferencialmente entre Th2 y Th2 tratados con 4μ8c

La ChIPmentación de XBP1 revela los genes diana directos de XBP1 en las células Th2

Para identificar la ocupación de la cromatina en todo el genoma de XBP1, realizamos la ChIPmentación, un método recientemente desarrollado que ha demostrado ser más rápido, sensible y robusto que los enfoques tradicionales de ChIP-seq , utilizando un anticuerpo de grado ChIP contra XBP1. Para el ChIP de XBP1 se utilizaron células Th2 diferenciadas y reactivadas in vitro. Se realizaron dos réplicas biológicas independientes. Se obtuvieron 19,3 millones y 22,4 millones de lecturas de extremo de par para cada réplica respectivamente. Utilizando MACS2 con un valor q inferior a 0,01 y un enriquecimiento de pliegues superior a 5, identificamos 9031 y 7662 picos, respectivamente, en las dos réplicas. El análisis de solapamiento utilizando bedtools sugirió que 5892 picos estaban presentes en ambas réplicas. Por lo tanto, sólo nos centramos en estos 5892 picos para el análisis posterior.

Como era de esperar, se identificaron picos de unión alrededor de las regiones promotoras en genes diana conocidos de XBP1, como Hspa5 que codifica la proteína BiP de la chaperona del RE también conocida como Grp78; también se observó un evento de unión alrededor del promotor del propio XBP1 (Fig. 4a), lo que indica una posible autorregulación de XBP1. Para averiguar las características genómicas asociadas a los sitios de unión de XBP1, comparamos su ubicación máxima con los genes RefSeq utilizando HOMER . La mayoría de los picos de unión de XBP1 se localizaron en el promotor (definido como aguas arriba de 1000 pb y aguas abajo de 500 pb en relación con los sitios de inicio transcripcional anotados) (36%) y en las regiones intrónicas (35%), y también se observó con frecuencia un evento de unión intergénica distal (25%) (Fig. 4b). La distribución genómica de los picos de XBP1 indica que se une tanto a promotores como a potenciadores potenciales.

Ocupación de la cromatina en todo el genoma del factor de transcripción XBP1 en el linfocito Th2. Se realizó la ChIPmentación de XBP1 en células Th2 diferenciadas in vitro para obtener la ocupación de la cromatina de XBP1 en todo el genoma. a Instantánea de los picos de unión de XBP1 alrededor de los genes representativos indicados del navegador del genoma de la UCSC. b Distribución genómica de los picos de unión de XBP1. El sector correspondiente al promotor incluye secuencias de hasta 1 kb aguas arriba y 100 pb aguas abajo del TSS. c Comparación de los motivos de XBP1 de la base de datos JASPAR (arriba), ChIP-seq de las líneas celulares de cáncer de mama humano (centro) y linfocitos Th2 de ratón (abajo). d Frecuencias de motivos de XPB1 y NF-Y alrededor de los picos de unión de XBP1. e Términos GO de procesos biológicos enriquecidos dentro de los picos de unión de XBP1 analizados por GREAT

Para caracterizar aún más el reguloma de XBP1, realizamos un descubrimiento de motivos de novo utilizando HOMER para identificar motivos de ADN enriquecidos dentro de las regiones de unión de XBP1. El principal motivo identificado es la secuencia consenso GCCACGT, que es casi idéntica al motivo de unión de XBP1 humano definido en líneas celulares de cáncer de mama (Fig. 4c). Esto indica que las especificidades de unión de XBP1 están muy conservadas entre el ser humano y el ratón y entre los distintos tipos de células. El motivo más enriquecido en nuestros datos de ratón también se asemeja al motivo de XBP1 de la base de datos JASPAR, apoyando de nuevo la alta calidad de nuestros datos de ChIPmentación. El segundo motivo más enriquecido es el motivo de unión a NF-Y (archivo adicional 1: figura S4C). Curiosamente, el motivo NF-Y se ha encontrado con frecuencia alrededor de las regiones promotoras de los genes del ciclo celular, especialmente los genes implicados en la regulación del ciclo celular G2/M . Tanto el motivo XBP1 como el motivo NF-Y coinciden en torno a un subconjunto de 258 picos de unión de XBP1 (Fig. 4d), lo que indica una posible cooperación entre los factores de transcripción XBP1 y NF-Y para regular un subconjunto de genes diana. La lista de genes diana potencialmente corregidos por XBP1 y NF-Y se muestra en el archivo adicional 3: Tabla S2, y la lista completa de dianas de XBP1 también se proporciona en el archivo adicional 3: Tabla S2. Los cinco principales motivos enriquecidos se muestran en el archivo adicional 1: Figura S4C. Para investigar las funciones de los genes unidos a XBP1, utilizamos GREAT para caracterizar los picos de unión de XBP1. La mayoría de los términos GO significativos están relacionados con el plegado de proteínas y el estrés del RE (Fig. 4e), lo que es coherente con el papel biológico conocido de XBP1.

En conjunto, los experimentos de ChIPmentación predicen un papel de XBP1 en la mejora del plegado y la secreción de proteínas, así como la activación de los linfocitos Th2.

Integración de datos transcriptómicos y datos de ChIP-seq para desentrañar la red de regulación génica controlada por XBP1

Para revelar los genes diana directos regulados por XBP1 y su red de regulación transcripcional, integramos los datos transcriptómicos de todo el genoma y los datos de ChIPmentación. Un gen diana directo se define por su expresión diferencial tras la inhibición de IRE1a (es decir, el tratamiento con 4μ8c) y la ocupación del factor de transcripción XBP1 en el locus del gen. Encontramos 1143 genes diana directa en Th2, de los cuales 122 dianas fueron reportadas previamente como diana directa de XBP1 en otros tipos celulares (es decir, músculo, célula β pancreática y célula plasmática) (Fig. 5a). En este contexto, 1021 genes pueden ser considerados como específicos de Th2. La acción de XBP1 sobre sus dianas directas no tiene una dirección definida, conteniendo genes regulados al alza y a la baja. Los 38 principales genes que siguen cualquiera de estos patrones se muestran en la Fig. 5b, y la lista completa se puede encontrar en el archivo adicional 4: Tabla S3. Los procesos y vías biológicas identificados más significativos están relacionados con el plegamiento de proteínas y el estrés del RE (archivo adicional 1: Figura S5), que son coherentes con sus funciones biológicas conocidas, y también incluyen nuevas dianas específicas de Th2.

La integración de los datos de ChIPmentación y RNA-seq revela los genes diana directos de XBP1 y su red reguladora. a Diagrama de Venn que compara los genes diana de XBP1 previamente reportados en otros tipos de células secretoras con los genes diana directos de Th2 de este estudio. Los genes diana directa de XBP1 de este estudio son los que son comunes en las categorías «Genes ocupados por XBP1 en Th2» y «Genes expresados diferencialmente (Th2 → Th2+4μ8c)». Los genes diana directa de XBP1 de las células B/plasmáticas, las células musculares esqueléticas y las células β pancreáticas fueron los observados por Acosta-Alvear et al. y se han utilizado aquí para la comparación. b Mapa de calor que muestra el patrón de expresión de los genes diana directa de XBP1. Se han mostrado los 38 genes principales que siguen un patrón distinto. c Red de regulación transcripcional: factores de transcripción que son diana directa de XBP1. Los genes de la red se expresan diferencialmente (upregulated-rojo; downregulated-azul) en el tratamiento con 4μ8c. Los factores de transcripción que no se expresan diferencialmente pero que tienen un pico de ChIPseq de XBP1 se muestran en la lista de la derecha

A pesar de la preponderancia del papel de XBP1 en el control de esta vía, también se encuentra la participación de otros factores de transcripción. Para examinar la cascada reguladora que sigue a la regulación de XBP1, construimos una red reguladora transcripcional extrayendo los factores de transcripción anotados con picos de ChIP-seq en el promotor o exónicos/intrónicos (Fig. 5c). La lista completa de los factores de transcripción se puede encontrar en el archivo adicional 5: Tabla S4. Esta red se complementó añadiendo los genes expresados diferencialmente que tienen interacciones anotadas con los factores de transcripción diana en la base de datos STRING (archivo adicional 6: Tabla S5).

Los factores de transcripción que están directamente regulados por XBP1 pueden clasificarse en tres amplias categorías funcionales implicadas en lo siguiente: resolución del estrés del RE secretor de proteínas, regulación del ciclo celular y de la proliferación, y control de la función de las células inmunes efectoras. Es probable que los factores de transcripción implicados en el estrés del RE faciliten la secreción de citoquinas en los linfocitos Th2. Esta predicción se basa en los informes anteriores sobre las células secretoras, como las células acinares pancreáticas y las células plasmáticas. Se ha demostrado que estos factores de transcripción, a saber, Bhlha15, Atf3, Atf6, Atf6b, Atf4 y Creb3l2, están implicados en la adaptación al estrés de secreción del RE.

La finalidad de los factores de transcripción relacionados con la proliferación celular y el ciclo celular podría ser facilitar la expansión rápida controlada de las células Th2 activadas. Los factores relacionados con la respuesta inmunitaria están probablemente implicados en la diferenciación de Th2 y la producción de citoquinas. Por lo tanto, queríamos comprobar el efecto de la regulación a la baja de XBP1s en la secreción de citoquinas, la proliferación celular y la producción de citoquinas.

La vía IRE1a-XBP1 controla la secreción de citoquinas en las células T helper

La comparación de los genes regulados por XBP1s en todo el genoma predice que el factor está implicado en la secreción de citoquinas. Para validar esta predicción, bloqueamos la actividad endonucleasa de IRE1a en las células Th2 y analizamos el sobrenadante del cultivo celular para cuantificar el nivel de IL4 por ELISA. Seleccionamos la IL4 como citoquina candidata comprobable porque su ARNm y su proteína no se modifican con la regulación a la baja de XBP1 (archivo adicional 1: Figura S6A panel izquierdo, Fig. 6 panel izquierdo y central de la fila superior). Encontramos que la secreción de IL4 se inhibe significativamente en las células tratadas con 4μ8c (Fig. 6, panel derecho de la fila superior). Como se esperaba, este resultado apoya la implicación de la vía IRE1a-XBP1 en la facilitación de la secreción de citoquinas en las células Th2, tal como se predijo. La inhibición de la vía durante la fase de reestimulación no tiene un efecto inhibidor significativo sobre la secreción de IL4 (archivo adicional 1: figura S6B). Este resultado sugiere que la vía XBP1 es necesaria durante la diferenciación Th2, posiblemente para el desarrollo de una maquinaria secretora eficiente.

La víaIRE1a-XBP1 es necesaria para la expresión y secreción de citoquinas en el linfocito Th2. Las células T helper naïve se cultivaron tras la condición de activación Th2 en presencia del inhibidor de IRE1a 4μ8c durante 3 días, descansaron durante 2 días, se reactivaron mediante placa recubierta y se analizaron por citometría de flujo para detectar la expresión de citoquinas intracelulares IL4, IL5 e IL13. En las dos primeras columnas se muestran perfiles FACS representativos. La expresión de citoquinas intracelulares se compara en la tercera columna, con tres a siete réplicas biológicas independientes. Cuarta columna: los sobrenadantes de cultivos celulares de Th2 tratados con 4μ8c o con DMSO se analizaron mediante ELISA para medir la concentración de citoquinas. Separación de FACS: linfocitos > solitarios > células vivas > citoquinas

La vía IRE1a-XBP1 controla la expresión de las citoquinas IL13 e IL5

IL5 e IL13 son dos destacadas citoquinas de tipo 2 que están implicadas en la eosinofilia, las alergias y la infección por helmintos. Encontramos que la inhibición de la vía IRE1a-XBP1 suprime significativamente la expresión y secreción de las proteínas IL5 e IL13 en el medio de cultivo (Fig. 6 paneles derechos de la fila central e inferior). El análisis bioinformático del transcriptoma Th2 predice que la vía IRE1a-XBP1 controla positivamente la expresión de los genes IL5 e IL13, ya que ambos genes fueron identificados como genes expresados diferencialmente tras la inhibición de IRE1a (archivo adicional 2: tabla S1). Validamos esta predicción mediante un análisis de expresión génica mediado por RT-qPCR (archivo adicional 1: Figura S6A, panel central y derecho) y citometría de flujo (Fig. 6). Estos resultados sugieren una implicación transcripcional de la vía que regula la IL5 y la IL13. En particular, los niveles de ARNm y proteína de IL4 no se ven afectados, lo que indica una regulación específica de IL5 e IL13.

La víaIRE1a-XBP1 facilita la proliferación de células T helper dependientes de la activación

La tasa de proliferación celular es un resultado de la interacción de reguladores positivos y negativos. Observamos que los genes que codifican los reguladores positivos y negativos de los genes de proliferación celular se expresan diferencialmente cuando la vía IRE1a-XBP1 fue bloqueada por 4μ8c (Fig. 7a, panel izquierdo, Archivo adicional 7: Tabla S6), de los cuales muchos genes resultaron ser objetivos directos de XBP1 (Fig. 7a, panel derecho, Archivo adicional 8: Tabla S7). Esta observación predice un cambio en la tasa de proliferación tras la inhibición de IRE1a. Por lo tanto, nos interesó comprobar el efecto de la inhibición de IRE1a-XBP1 en la proliferación celular. Realizamos un ensayo de proliferación celular utilizando células Th2. Se marcaron células T CD4+ esplénicas naïve con CellTrace violeta y se activaron en condiciones de diferenciación Th2 en presencia o ausencia de 4μ8c. La decadencia del colorante fluorescente se monitorizó mediante citometría de flujo. Encontramos que la regulación a la baja de XBP1s inhibe significativamente la proliferación celular (Fig. 7b), pero no induce la muerte celular (archivo adicional 1: Figura S7).

La víaIRE1a-XBP1 promueve la proliferación y el ciclo celular de las células Th2 dependientes de la activación. a Panel izquierdo: agrupación jerárquica de los genes asociados a la proliferación celular expresados de forma diferencial en el transcriptoma Th2 tratado con 4μ8c y no tratado. Panel de la derecha: agrupación jerárquica de los genes diana directa de XBP1 que se sabe que están implicados en la proliferación celular. El mapa de calor muestra los valores de expresión escalados denotados como puntuación Z de la fila, en una escala de color rojo-azul en la que el rojo indica un aumento de la expresión y el azul una disminución de la misma. b Las células T helper naïve esplénicas se tiñeron con el colorante CellTrace Violet y se activaron durante 72 h en condiciones de diferenciación Th2 y se analizaron mediante citometría de flujo. Las generaciones de células Th2 aparecen en «rojo» y las células tratadas con 4μ8c en «azul» en el histograma de proliferación celular (panel izquierdo, un experimento representativo). Representación gráfica del índice de división obtenido a partir de cinco réplicas biológicas independientes (panel derecho)

La proliferación de células T helper está asociada a la diferenciación y a la producción de citoquinas. La reducción de la expresión de IL5 e IL13 (Fig. 6) podría explicarse potencialmente por el hecho de que la proliferación celular se retrasa. Sin embargo, si la reducción de la proliferación fuera la razón principal de la falta de secreción, la producción de IL4 también estaría inhibida. Sin embargo, no observamos ningún cambio significativo en la expresión de IL4 tras la inhibición de IRE1a (Fig. 6, Archivo adicional 1: Figura S6A). Para examinar más a fondo esta discrepancia, realizamos ensayos de proliferación celular utilizando líneas de ratón reporteras de IL13-GFP e IL4-GFP. En las células Th2 que expresan IL4-GFP, observamos una inhibición de la producción de IL4 en las primeras generaciones de la división celular hasta las 72 h tras el tratamiento con 4μ8c (archivo adicional 1: figura S8). Pero a las 96 h, la diferencia en la expresión de IL4 se vuelve insignificante independientemente de la generación de división celular en la que se encuentren las células. Esta observación sugiere que el retraso de la proliferación debido a la inhibición de IRE1a no es suficiente para inhibir la expresión de IL4. Por el contrario, en IL13-GFP, observamos la disminución de la expresión de IL13 desde la primera generación y esto continúa a lo largo de las generaciones posteriores (archivo adicional 1: Figura S9).

La inhibición deIRE1a retrasa la progresión del ciclo celular a través de la fase S y G2/M

El análisis bioinformático de los genes expresados diferencialmente (Th2 frente a Th2 tratado con 4μ8c) y de los genes diana directa de XBP1 revela varios genes que están implicados en el control de la progresión del ciclo celular a través de diferentes etapas (es decir, G1, S, G2/M) se agruparon en dos grupos regulados al alza o a la baja (Fig. 8a). Tomamos los genes expresados diferencialmente en 4μ8c tratados Th2 en comparación con Th2 no tratados (valor p ajustado < 0,05) (Fig. 8a, izquierda, archivo adicional 9: Tabla S8) y los genes expresados diferencialmente XBP1 genes diana directa (Fig. 8a, derecha, archivo adicional 10: Tabla S9), y comprobado para los roles conocidos a través de distintas etapas del ciclo celular utilizando ya sea una lista curada manualmente sobre la base de datos de ARN-seq o publicado base de datos . Encontramos que muchos genes de todas las etapas del ciclo celular (es decir, G1, S y G2/M) estaban afectados. Para identificar las etapas del ciclo celular reguladas por la vía IRE1a-XBP1, creamos y utilizamos una cepa de ratón transgénico FUCCI (indicador del ciclo celular de ubiquitina fluorescente) que expresa la proteína Cdt1 marcada con mCherry y la proteína Geminin marcada con mVenus. La cepa es similar a la utilizada en . Las células G1 son mCherry+ mVenus- (Q3; Fig. 8b), las células G1-S son mCherry+ mVenus+ (Q2; Fig. 8b), y las SG2M son mCherry- mVenus+ (Q1; Fig. 8b), mientras que las células en mitosis y entrando en G1 son mCherry- mVenus- (Q4; Fig. 8b). Comparamos los perfiles del ciclo celular de las células Th2 tratadas con vehículo y con 4μ8c durante la activación de las células T. Encontramos que las células se acumulaban en la fase S y/o G2/M cuando se bloquea la vía IRE1a-XBP1 (Fig. 8b). Se obtuvieron resultados similares en un enfoque diferente utilizando el ensayo de incorporación de BrdU con tinción de DAPI (archivo adicional 1: Figura S10).

La inhibición deIRE1a retrasa la progresión del ciclo celular a través de la fase S y G2/M. a Panel izquierdo: mapa de calor de los genes asociados a la fase del ciclo celular expresados diferencialmente en el transcriptoma de Th2 tratado con 4μ8c y no tratado. Panel de la derecha: mapa de calor de los genes diana directa de XBP1 que se sabe que están implicados en el ciclo celular. El mapa de calor muestra los valores de expresión escalados denotados como puntuación Z de fila, en escala de color rojo-azul con el rojo indicando el aumento de la expresión y el azul indicando la disminución de la expresión. b Análisis del ciclo celular de los linfocitos Th2 después de 72 h de activación, utilizando la línea de ratones FUCCI que expresan CDT1 marcado con mCherry y GEMININ marcado con Venus. Arriba a la izquierda: representación diagramática de las fases del ciclo celular en el ratón FUCCI utilizado. Superior derecha: comparación de las células (% del total) obtenidas en las diferentes etapas del ciclo celular en Th2 y Th2 tratado con 4μ8c (n = 6). Paneles inferiores: un perfil FACS representativo de Th2 y Th2 tratado con 4μ8c que muestra células que expresan CDT1 y GEMININ

La expresión transgénica de XBP1s complementa la inhibición de la actividad endonucleasa de IRE1a mediada por 4μ8c

Para comprobar si los fenotipos observados en el tratamiento con 4μ8c se debían a la pérdida de XBP1s, realizamos ensayos de complementación transduciendo un vector de expresión de XBP1s en las células Th2 in vitro. El vector codificaba la forma empalmada de XBP1 (XBP1s), cuya función es independiente de la función de IRE1a. Descubrimos que la expresión ectópica estable de XBP1s anula el efecto del tratamiento con 4μ8c y no hay ningún cambio significativo en el transcriptoma tras el tratamiento con 4μ8c cuando las células Th2 sobreexpresan XBP1s (archivo adicional 1: figura S11A). Las células Th2 que sobreexpresan XBP1s proliferan y se diferencian normalmente en presencia de 4μ8c (archivo adicional 1: figura S11B y S11C respectivamente). Estos resultados sugieren firmemente que los fenotipos observados tras el tratamiento con 4μ8c se deben a la pérdida de XBP1s.