Establecimiento de un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico humano en ratones inmunocompetentes utilizando la microportadora-6
Abstract
El cáncer gástrico se encuentra entre los tumores malignos más comunes del tracto digestivo. Establecer un modelo animal robusto y fiable es la base para estudiar la patogénesis del cáncer. En el presente estudio se estableció un modelo de ratón de carcinoma gástrico mediante la inoculación de ratones inmunocompetentes con células MKN45 utilizando microportadores. Sesenta ratones machos C57BL/6 se dividieron aleatoriamente en tres grupos: un grupo 2D, un grupo de portador vacío y un grupo 3D, según el sistema de cocultivo de MKN45 y el microportador. Los modelos de ratón se establecieron mediante inyección hipodérmica. En cada grupo se observó el tiempo de desarrollo del tumor, la tasa de formación del mismo y las características patológicas. En el grupo 3D, el tiempo de tumorigénesis fue corto, mientras que la tasa de formación de tumores fue alta (75%). No hubo formación tumoral detectable ni en el grupo 2D ni en el grupo de portadores vacíos. Tanto la tinción H&E como la inmunohistoquímica del xenoinjerto tumoral mostraron evidencias características de las neoplasias gástricas humanas. El presente estudio estableció con éxito un modelo de carcinoma gástrico humano en ratones inmunocompetentes, que proporciona un modelo animal novedoso y valioso para la investigación del cáncer y el desarrollo de fármacos anticancerosos.
1. Introducción
Con aproximadamente un millón de nuevos casos diagnosticados anualmente, el cáncer gástrico representa una grave amenaza para la salud y la vida de las personas en todo el mundo . Sin embargo, la patogénesis y los mecanismos de metástasis del cáncer gástrico aún no han sido completamente aclarados. Los modelos in vivo de cáncer gástrico son herramientas esenciales para explorar las características biológicas de este cáncer y las posibles opciones de tratamiento novedosas . Se han establecido modelos de xenoinjerto de cáncer gástrico de origen humano en ratones inmunodeficientes, como los ratones nude y los ratones con inmunodeficiencia combinada grave. Sin embargo, los ratones inmunodeficientes no son fáciles de criar y son costosos. Además, los ratones inmunodeficientes no reflejan las importantes funciones del sistema inmunitario en el desarrollo y la progresión de los tumores. Por lo tanto, el establecimiento de un nuevo modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico humano en ratones con un sistema inmunitario normal es de gran importancia. En el presente estudio, se cocultivaron MKN45, células de cáncer gástrico humano y el microportador, y posteriormente se inocularon ratones inmunocompetentes con la suspensión, estableciendo con éxito un novedoso xenoinjerto de cáncer gástrico de origen humano.
2. Materiales y métodos
2.1. Materiales
Medio de cultivo RPMI 1640 del Roswell Park Memorial Institute, tripsina, suero bovino fetal y penicilina fueron adquiridos de Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Los anticuerpos monoclonales de conejo contra el antígeno carbohidrato 199 (CA199), la citoqueratina 7 (CK-7) y la homeobox 2 de tipo caudal (CDX-2) se adquirieron en Abcam (Cambridge, Reino Unido). El microcarrier-6 se compró a Elyon Biotechnologies LLC (Gaithersburg, MD, EE.UU.).
2.2. Animales experimentales
Sesenta ratones C57BL/6 machos de 6-8 semanas de edad que pesaban entre 22 y 25 g se adquirieron en Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co. (número de licencia: SCXK 20140007, provincia de Shandong, China) y se alojaron en un centro de animales libre de patógenos específico en el Hospital Afiliado del Colegio Médico de Jining (provincia de Shandong, China). Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Jining y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas.
2.3. Líneas celulares
La línea celular de cáncer gástrico humano MKN45 se adquirió en el Banco de Células de la Academia China de Ciencias (Shangai, China) y se cultivó en medio RPMI-1640 que contenía un 10% de suero bovino fetal y 100 U/mL de penicilina a 37°C con un 5% de CO2. El medio de cultivo se cambió cada 24 horas y las células se cosecharon por digestión con tripsina al 0,25%.
2.4. Establecimiento de un modelo de cultivo de células tumorales tridimensionales (3D)
El microportador-6 se empapó en etanol al 75% durante 24 h, se lavó tres veces con solución salina tamponada con fosfato 1x y se incubó en medio RPMI-1640 durante 24 h. Posteriormente, el microportador-6 se modificó mediante una incubación de 3 h con factor-1 alfa derivado de células estromales (SDF-1α) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ambos a una concentración de 100 ng/mL. Las células en fase de crecimiento logarítmico se contaron tras la tinción con azul tripán y se ajustaron a una concentración de cuando la viabilidad era >95%. La suspensión de células MKN45 se mezcló con el microportador-6 modificado y se incubó a 37°C con un 5% de CO2 durante otras 24 horas para saturar las células con el microportador, como se observó por microscopía (Figuras 1(c) y 1(d)).
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2.5. Agrupación de animales
Los 60 ratones C57BL/6 se dividieron aleatoriamente en tres grupos (20 ratones por grupo): el grupo bidimensional (2D) (animales inoculados con containing ), el grupo de portador vacío (animales inoculados con containing 30 μg de microportador-6), y el grupo 3D (animales inoculados con containing y 30 μg de microportador-6).
2.6. Generación del modelo animal
El modelo de cultivo de células tumorales en 3D se estableció el primer día del experimento y se incubó durante 24 h. El segundo día, los complejos célula-microportador cultivados se lavaron tres veces en y se mezclaron suavemente con para ajustar la concentración a células y 300 μg de microportador-6 por 1 mL de suspensión, y se colocaron en hielo para su uso posterior. Las células MKN45 en fase de crecimiento logarítmico se cosecharon, se tripsinizaron, se lavaron tres veces con , y se resuspendieron en a una concentración de , que se colocó en hielo para su uso posterior. La microportadora-6 modificada se lavó tres veces con , se resuspendió en a una concentración de 300 μg/mL y se colocó en hielo para su uso posterior. Cada ratón de los tres grupos experimentales fue inoculado con 100 μL de la solución correspondiente bajo la cresta axilar derecha.
2.7. Detección de indicadores y examen patológico
Después de la inoculación, los ratones se alojaron por separado por grupo, y se controlaron el apetito, las actividades y el peso diarios. Se registró el tiempo de formación del tumor local y el volumen del tumor en cada ratón. Una vez que los tumores fueron visibles, se midió diariamente el diámetro largo (a) y el diámetro corto (b) de cada tumor, y se calculó el volumen tumoral según la fórmula de volumen tumoral : . Los ratones portadores de tumores se sacrificaron en tres lotes: 10, 20 y 30 días después de la inoculación. Se extrajeron completamente los tejidos tumorales de cada ratón y se registraron la calidad, la textura y el grado de infiltración y necrosis del tumor. Los tejidos tumorales se fijaron posteriormente en formaldehído neutro al 4% y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Para la inmunohistoquímica se utilizó la técnica de tinción de dos pasos EnVision. Los resultados de la tinción se determinaron basándose en la tinción citoplasmática granular positiva del tumor. La tinción negativa (-ve) se definió como <5% de células teñidas positivamente, y la tinción positiva (+ve) se definió como ≥5% de células teñidas positivamente.
2.8. Análisis estadístico
Para el análisis estadístico se utilizó el software SPSS 13.0 (IBM SPSS, Chicago, IL, USA). Los datos de las mediciones se presentan como medias ± error estándar de la media (SEM). Las diferencias entre los valores medios de cada grupo se compararon mediante el análisis de varianza de una vía (ANOVA) o la prueba de Kruskal-Wallis, según el caso. se considera una diferencia estadísticamente significativa.
3. Resultados
3.1. Establecimiento del sistema de cultivo de tumores 3D in vitro MKN45 utilizando el microportador-6
El microportador-6 es un novedoso microportador compuesto por polímeros orgánicos positivamente electrificables con una estructura porosa multicapa. El tamaño de los poros, la densidad de carga superficial positiva y el tamaño del microportador-6 pueden ajustarse mediante síntesis química. El microportador de tipo C, de pequeño volumen, gran tamaño de poro y muchas veces plegable en el espacio, se utiliza principalmente para el cultivo de células en 3D y los experimentos de sensibilidad a los fármacos (Figuras 2(a) y 2(b)). El microportador de tipo M, de gran volumen, tamaño de poro pequeño y bajos tiempos de plegado interno, se utiliza principalmente para la investigación en ingeniería de tejidos (Figuras 2(c) y 2(d)). En nuestro estudio se utilizó el microportador de tipo C. El microportador-6 es un compuesto orgánico puro que no es propenso a la contaminación, no tiene impurezas, es bajo en inmunogenicidad y metabolismo, y es altamente biocompatible, proporcionando un microambiente estable para el crecimiento celular (Figuras 2(a)-2(d)). Además, el microportador-6 se incrusta directamente en la piel de los ratones, induciendo el crecimiento de vasos sanguíneos (Figuras 2(e) y 2(f)), lo que puede proporcionar un suministro de sangre suficiente para el crecimiento de las células tumorales. Las células MKN45 se adhirieron rápidamente en el entorno 2D, y la morfología celular observada por microscopía tras 24 h de cultivo presentaba una forma poligonal irregular (Figura 1(a)). El microportador-6 presentaba una forma irregular o de huso largo y una textura suelta (Figura 1(b)). Tras un cocultivo de 24 horas de MKN45 y el microportador-6 modificado, las células MKN45 se adhirieron bien al microportador y alcanzaron la confluencia. Además, se observaron grupos celulares irregulares alrededor de las células MKN45 adheridas al microportador-6 (Figura 1(c)). Los complejos célula MKN45-microportador se tiñeron con una solución de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), revelando un gran número de células MKN45 adheridas al andamio del microportador-6 (Figura 1(d)). La estructura porosa multicapa de los microportadores puede observarse al microscopio electrónico de barrido (Figura 1(e)). Las células MKN45 se adhirieron a los microportadores, y las células adheridas a la superficie formaron grupos de células (Figura 1(f)).
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3.2. Supervivencia de los ratones y formación de tumores
No se observaron cambios significativos en el apetito, el pelaje o el peso corporal entre los grupos durante el experimento (Tabla 1). Los ratones del grupo 3D mostraron una ligera disminución de la actividad una semana después de la inoculación. Ningún animal murió en ningún grupo, y no se encontró formación de tumores en los grupos de portador vacío o 2D durante el experimento de 30 días. En 15 de los 20 ratones del grupo 3D se identificaron masas subcutáneas mediante palpación a los 7-10 días de la inoculación, lo que sugiere una tasa de formación de tumores del 75% (Tabla 1). Los xenoinjertos tumorales crecieron rápidamente y se observaron como masas subcutáneas aproximadamente 10 días después de la inoculación (Figura 3(a), Figura suplementaria 3). Los xenoinjertos tumorales crecieron hasta alcanzar un tamaño de 0,5-1,0 cm3 entre 2 y 3 semanas después de la inoculación. Los tejidos del xenoinjerto tumoral se separaban fácilmente de los tejidos adyacentes y presentaban formas relativamente regulares, en su mayoría redondas u ovaladas, de color blanco grisáceo o rojo grisáceo, y con un abundante suministro de sangre periférica (Figuras 3(b) y 3(c) y Figura Suplementaria 3). Hubo cambios histológicos en el lugar de la inyección en el grupo de portadores vacíos, pero no hubo cambios en el grupo 2D (Figuras 3(d) y 3(e)). Se observaron pequeñas masas subcutáneas de color amarillo en el grupo de portadores vacíos (Figura 3(d)).
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3.3. Tinción H&E
La histomorfología, observada mediante microscopía óptica, mostró un gran número de células desordenadas y atípicas en los xenoinjertos tumorales de los ratones del grupo 3D (Figuras 4(a)-4(c)). Se observó un gran número de células heterotípicas, microportadores residuales y abundantes vasos sanguíneos, 10 días después de la inoculación (Figura 4(a)). Se observó un pequeño número de microportadores residuales (Figura 4(b)) y un gran número de lesiones necróticas (Figura 4(d)), 20 días después de la inoculación. Sin embargo, los microportadores se eliminaron sustancialmente 30 días después de la inoculación (Figura 4(c)). Se observó un gran número de microportadores y un pequeño número de células inflamatorias en el grupo de portadores vacíos, pero no se encontraron células tumorales (Figura 4(e)).
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3.4. Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se llevó a cabo en animales eutanasiados 20 días después del xenoinjerto tumoral. Los tejidos del xenoinjerto tumoral mostraron una tinción positiva para CA199, CK-7 y CDX-2 (Figuras 4(f)-4(h)), confirmando además que las células atípicas eran células tumorales de origen humano.
4. Discusión
Los modelos animales se han utilizado ampliamente para estudiar la patogénesis y los mecanismos metastásicos del cáncer gástrico y desempeñan un papel extremadamente importante en la evaluación de la eficacia y toxicidad de los fármacos terapéuticos . En la actualidad, los modelos animales de cáncer gástrico incluyen principalmente los siguientes: el modelo de inducción, el modelo de trasplante y el modelo de ingeniería genética. Entre los tres tipos de modelos, el modelo de trasplante es de fácil manejo y, por tanto, muy utilizado. El tipo de animales de experimentación, los xenoinjertos tumorales y el lugar y la vía de trasplante se han considerado factores que afectan al éxito de los modelos de xenoinjerto . Los ratones con defectos en la función inmunitaria, como los ratones nude y los ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID), se utilizan habitualmente para los modelos de xenoinjerto . Sin embargo, debido al coste comparativamente caro, la corta vida útil y la falta de respuesta inmunitaria a los tumores en los ratones con inmunodeficiencia, seleccionamos ratones C57BL/6 inmunocompetentes para el modelo de xenoinjerto con el fin de evitar las deficiencias de los ratones con inmunodeficiencia. En general, se cree que la aparición del cáncer gástrico no está relacionada con el nivel de estrógenos, y la incidencia del cáncer gástrico en los machos es mayor que en las hembras. Por lo tanto, utilizamos ratones machos como modelos. Además, en el presente estudio se utilizaron células de cáncer gástrico humano MKN45 para establecer el modelo in vitro, principalmente debido a las fuertes características invasivas y metastásicas de la línea celular. Además, la región subcutánea de la axila y el trasplante ectópico fueron seleccionados como el sitio y la ruta de trasplante de células tumorales, respectivamente, como resultado del abundante suministro de sangre y la estructura de tejido suelto de esta área, que facilita el crecimiento del tumor en los ratones .
Como un puente entre el sistema de cultivo celular 2D y el modelo animal, el sistema de cultivo celular 3D simula mejor el microambiente del crecimiento de las células tumorales y se ha convertido en un tema atractivo en la investigación actual . El cultivo en 3D de células cancerosas formará organoides tumorales, y los modelos de xenoinjertos tumorales de ratón basados en organoides tumorales han comenzado a aplicarse al cribado de fármacos anticancerosos . El presente estudio utilizó el novedoso microcarrier-6 y las células MKN45 para los experimentos de cocultivo y establecer con éxito un modelo de crecimiento en 3D. Hemos incrustado directamente el microportador-6 en el tejido subcutáneo de los ratones para permitir que los vasos sanguíneos entren en los microportadores, lo que supone una ventaja específica que no se consigue con otros microportadores. Los estudios han informado de la inmunosupresión leve de ratones inmunocompetentes para lograr la resistencia a las células tumorales humanas, estableciendo con éxito un modelo de ratón portador de tumores ; sin embargo, hasta la fecha, no hay informes de trasplante ectópico exitoso de un tumor humano en ratones normales en condiciones no inmunosupresoras. Además, cuando ajustamos la concentración de células MKN45 e inyectamos inmediatamente 100 μL de suspensión de células MKN45 por vía subcutánea a cada ratón, no se logró la formación de un tumor estable debido a la fuerte eliminación inmunitaria de las células tumorales humanas trasplantadas ectópicamente. El microportador-6 utilizado en el presente estudio presentaba una baja inmunogenicidad y una textura suelta con numerosos poros en el centro, lo que facilitaba el crecimiento de las células tumorales. El microportador-6 también actuó como barrera para impedir que las células inmunitarias eliminaran directamente las células tumorales. El microportador-6 modificado permitió que los vasos sanguíneos crecieran fácilmente en el interior del tumor, proporcionando las condiciones adecuadas para el rápido crecimiento de las células tumorales.
La inmunidad celular es el principal ejército contra el crecimiento de los tumores; las células implicadas incluyen principalmente células T, células asesinas naturales, macrófagos y células dendríticas . Debido a la estructura irregular en forma de «laberinto» del microportador-6, éste puede actuar como barrera a corto plazo y bloquear hasta cierto punto la eliminación directa de las células tumorales por parte de las células inmunitarias. Además, tres horas antes del experimento, el microportador-6 se modificó aún más con SDF-1α y VEGF para acelerar la formación de vasos sanguíneos y proporcionar un suministro de sangre para el rápido crecimiento del tumor, lo que superó el efecto inmunológico antitumoral de los ratones. Simultáneamente, descubrimos que los macrófagos de la sangre periférica y de los tejidos esplénicos de los ratones disminuyeron significativamente durante la fase inicial de la formación del tumor trasplantado, en comparación con el grupo de control normal (Figura suplementaria 1). El número de macrófagos de la médula ósea disminuyó gradualmente entre el grupo portador vacío, el grupo 2D y el grupo 3D, pero no hubo significación estadística (Figura suplementaria 2A, 2B). En comparación con el grupo portador vacío, el número de linfocitos T del bazo en el grupo 2D se redujo, pero no hubo significación estadística (Figura suplementaria 2C). El número de linfocitos T del bazo en el grupo 3D fue significativamente menor que en el grupo 2D (Figura suplementaria 2C). Esto sugiere que el crecimiento del tumor inhibió el sistema inmunitario, permitiendo que el tumor creciera rápidamente.
El presente estudio estableció un modelo de crecimiento de células MKN45 en 3D, estableciendo con éxito un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico humano en ratones inmunocompetentes en el grupo 3D, mientras que los ratones de los grupos 2D y portador vacío no formaron ningún tumor. Este modelo de xenoinjerto se caracterizó por el rápido crecimiento de los tumores, que podían palparse con la mano entre 7 y 10 días después de la inoculación y que alcanzaron un crecimiento óptimo entre 10 y 15 días después de la inoculación; el volumen del tumor era de 0,5-1,0 cm3 aproximadamente 20 días después de la inoculación. Mediante la tinción con H&E se detectó un gran número de células con atipia nuclear que se habían infiltrado en los tejidos muscular y graso. La microportadora-6 residual estaba rodeada de células inflamatorias y formaba granulomas con una gran zona de necrosis en el centro, lo que probablemente estaba causado por un suministro insuficiente de sangre debido al rápido crecimiento del tumor. Estos fenómenos son coherentes con el desarrollo de tumores en humanos. Además, los abundantes capilares se encontraban principalmente en la periferia de los tumores. En la actualidad, no existe ningún marcador tumoral específico para el cáncer gástrico; sin embargo, CA199, CK-7 y CDX-2 se utilizan habitualmente como marcadores de tumores gastrointestinales. Por lo tanto, elegimos estos tres marcadores para el etiquetado y la identificación de las células cancerosas gástricas derivadas de seres humanos. La tinción inmunohistoquímica de CA199, CK-7 y CDX-2 fue positiva, confirmando además que las células heteromórficas eran células de cáncer gástrico humano.
5. Conclusiones
Hemos establecido con éxito un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico humano en ratones inmunocompetentes. Este modelo puede reflejar la interacción entre el sistema inmunitario del organismo y los tumores y tiene amplias perspectivas de aplicación en la investigación futura sobre la inmunidad de los tumores, así como en la investigación y el desarrollo de nuevos fármacos.
Disponibilidad de los datos
Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud.
Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Contribuciones de los autores
Yanzhen Bi, Quanyi Wang y Yonghong Yang contribuyeron a partes iguales a este trabajo.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81170395 y 81570556), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jilin (20180101137JC y 20180101130JC), y el Fondo de Investigación para la Estación de Trabajo Académica de Lin He de Nueva Medicina y Traducción Clínica en la Universidad Médica de Jining (JYHL2019FMS21).
Materiales suplementarios
Los cambios de las células inflamatorias y otros datos tumorales. Figura suplementaria 1: los cambios de las células inflamatorias en los ratones portadores de tumores durante la etapa inicial de la formación del tumor trasplantado. Figura suplementaria 2: los cambios de las células inflamatorias en diferentes grupos durante la fase inicial de la formación del tumor trasplantado. Figura suplementaria 3: ratones portadores de tumores y tejidos tumorales trasplantados. (Materiales suplementarios)