Las cepas bla KPC-E. coli son diversas, incluso dentro de la ST más prevalente, la ST131, con evidencia de transmisión local

Se obtuvieron 45 aislados de 21 ciudades en 11 países de cuatro continentes (2010-2013; los resultados de tipificación de laboratorio anteriores se resumen en la Tabla S1). Un aislado fue negativo para bla KPC en la secuenciación del genoma completo (WGS; ecol_252), ya que podría haber perdido bla KPC durante el almacenamiento o el subcultivo en el período de tiempo transcurrido entre la tipificación original y la posterior extracción de ADN y preparación para la WGS. En el caso de un aislado, los datos de la WGS no coincidían con los resultados de la tipificación de laboratorio (ecol_451), lo que probablemente representaba una confusión de laboratorio; por lo tanto, ecol_252 y ecol_451 se excluyeron de los análisis posteriores. Los otros 43 aislados fueron secuenciados con éxito (para las métricas de calidad, véase la Tabla S1). Entre estos 43 aislados, estaban representados veintiún ST de E. coli diferentes (Tabla 1; predicción in silico a partir de WGS), incluyendo: ST131 , ST410 , ST38 , ST10, ST69 (el resto de aislados son STs únicos).

De los 16.053 marcos de lectura abiertos (ORF) anotados e identificados en todos los aislados de KPC-E. coli, sólo 2.950 (18,4%) fueron compartidos en todos los aislados («núcleo»), y otros 222 (1,4%) en el 95- < 100% de los aislados («núcleo blando «27). A nivel de nucleótidos, había 213.352 variantes de un solo nucleótido (SNV) en el genoma central, lo que coincide con la diversidad de especies observada anteriormente28. Los perfiles de los genes de resistencia también variaron notablemente entre las cepas, ya que algunas albergaban varios mecanismos de resistencia a betalactámicos, aminoglucósidos, tetraciclinas y fluoroquinolonas (por ejemplo, ecol_224) y otras sólo contenían bla KPC (por ejemplo, ecol_584; Fig. 1). Para las 16 cepas KPC-ST131, 4.071/7.910 (51%) ORFs eran centrales, con 6.778 SNVs a través del genoma central de estos aislados, de nuevo en consonancia con los estudios globales anteriores de la diversidad ST13123, 24 (Figura S1). Los genomas accesorios fueron altamente concordantes para algunos (por ejemplo, ecol_356/ecol_276/ecol_875), pero no para todos (por ejemplo, ecol_AZ159/ecol_244) los aislados que estaban estrechamente relacionados en sus genomas centrales, apoyando una dinámica evolutiva muy variable entre los genomas centrales y los accesorios (Fig. 1). La distribución geográfica de los aislados estrechamente relacionados tanto en el núcleo como en los genomas accesorios apoya la transmisión local (por ejemplo, ecol_AZ166, ecol_AZ167 ) de determinadas cepas de KPC-E. coli. La homología de los motivos genéticos de flanqueo alrededor de los genes bla KPC en estos pares de aislados estrechamente relacionados también sería consistente con esta hipótesis, y menos consistente con múltiples eventos de adquisición de bla KPC dentro del mismo fondo genético, especialmente dada la diversidad en las secuencias de flanqueo de bla KPC observadas en el resto del conjunto de datos (ver más abajo).

Filogenia de KPC-Escherichia coli identificada a partir de los esquemas globales de vigilancia de la resistencia a los carbapenemes, 2008-2013. Los paneles a la derecha de la filogenia representan los mecanismos genéticos de resistencia comunes (detalles completos de la tipificación de genes de resistencia en la Tabla S2), y los componentes del genoma central y accesorio. Para el panel del genoma accesorio, el azul representa las regiones anotadas que están presentes, y el blanco las que están ausentes.

Los genes bla KPC parecen estar restringidos a contextos de plásmidos en E. coli en la actualidad, pero pueden existir en copias múltiples en estructuras de plásmidos individuales o en plásmidos de alto número de copias

Treinta y cuatro aislados (80%) contenían bla KPC-2, y nueve aislados (20%) bla KPC-3. La integración cromosómica de bla KPC se ha descrito en otras Enterobacteriaceae, Pseudomonas y Acinetobacter spp. pero sigue siendo rara5, 29, 30. No hubo evidencia de integración cromosómica de bla KPC ni en las 18 estructuras cromosómicas reconstruidas a partir de la secuenciación de lectura larga, ni en base a la revisión de las anotaciones en los contigs que contienen bla KPC (derivados de los ensamblajes de novo de Illumina) para los otros 25 aislados. Los alelos de bla KPC no fueron segregados por ST.

Las estimaciones del número de copias de bla KPC por cromosoma bacteriano variaron entre <1 (ecol_879, ecol_881) y 55 (ecol_AZ152). En nueve casos esta estimación fue ≥10 copias de bla KPC por cromosoma bacteriano (ecol_276, ecol_356, ecol_867, ecol_869, ecol_870, ecol_875, ecol_AZ150, ecol_AZ152, ecol_AZ159, Tabla S2). Seis de estos aislados contenían bla KPC en un contexto plasmídico de tipo col, en dos casos se desconocía el tipo de réplica del plásmido y en un caso se trataba de un replicón IncN. El número de copias del plásmido se asocia con niveles más altos de resistencia a los antibióticos si el gen relevante se encuentra en una unidad de alto número de copias. Curiosamente, se postula que los plásmidos de alto número de copias tienen mayores posibilidades de fijarse en las células descendientes, ya que se distribuyen más adecuadamente por azar y sin el requisito de sistemas de partición31, y de ser transferidos en cualquier evento de conjugación, ya sea directa o indirectamente32,33,34.

Las poblaciones de plásmidos bla KPC y no bla KPC en las cepas globales de KPC-E. coli son extremadamente diversas

La tipificación del plásmido Inc reveló la presencia de una mediana de cuatro tipos de replicones de plásmidos por aislado (rango: 1-6; IQR: 3-5), lo que representa una amplia diversidad (Tabla 1). Sin embargo, los replicones IncN, col, IncFIA e IncI1 estaban desproporcionadamente sobrerrepresentados en determinadas TS (p < 0,05; Tabla 1). Entre los 18 aislados que se sometieron a la secuenciación PacBio, se identificaron 53 plásmidos KPC cerrados, que oscilaban entre 1.459 pb y 289.903 pb (Tabla S1; había al menos cuatro estructuras plasmídicas adicionales parcialmente completas). De estos plásmidos KPC que no sonbla, 10 (tamaño: 2.571-150.994 pb) tenían una similitud <70% (definida por el porcentaje de identidad de la secuencia multiplicado por la proporción de la longitud de la consulta que demuestra la homología) con otras secuencias disponibles en GenBank, lo que pone de manifiesto que una proporción del «plasmidoma» de KPC-E. coli sigue estando incompletamente caracterizada. Para los otros 43 plásmidos, la mayor coincidencia en el GenBank fue un plásmido de E. coli en 35 casos, de K. pneumoniae en 5 casos, y de Citrobacter freundii, Shigella sonnei y Salmonella enterica en 1 caso cada uno (Tabla S3).

Se resolvieron completamente 22 estructuras de plásmidos de bla KPC (17 a partir de datos de Pacbio solamente, cuatro a partir de datos de Illumina solamente, 1 a partir de datos tanto de PacBio como de Illumina), con un rango de 14.029 pb a 287.067 pb (mediana = 55.590 pb; IQR: 23.499-82.765 pb). Estos plásmidos que contienen bla KPC, y seis casos adicionales en los que se identificó bla KPC en un contig que contenía un replicón, eran muy diversos según la tipificación Inc (Tabla S1). El IncN fue el tipo más común (n = 8/28 estructuras bla KPC tipificables; 29%), seguido de los plásmidos pequeños tipo col (n = 6/28 ; 21%). Otros tipos menos comunes fueron: A/C2, FII(k), U (todos n = 2); y L/M, P, Q1 y R (todos n = 1). Cuatro (14%) plásmidos bla KPC eran construcciones multirreplicantes, a saber: col/repA, FIB/FII, FIA/FII y FIA/FII/R.

Los plásmidos comunes IncN se han dispersado globalmente dentro de E. coli

Del GenBank, seleccionamos todas las secuencias de plásmidos IncN-bla KPC únicas y completamente secuenciadas (Tabla S4) para su comparación, que datan de 2005, alrededor del momento de los primeros informes de E. coli productora de KPC. Los esqueletos de los plásmidos y las secuencias de flanqueo que rodean a bla KPC en estas 16 referencias de plásmidos y en un subconjunto de 12 secuencias de estudio (véase «Métodos») eran coherentes con las múltiples adquisiciones de dos complejos conocidos de IncN-Tn4401-bla KPC en STs divergentes de E. coli: en primer lugar, dentro de un fondo similar al plásmido-9 (FJ223607, 2005, EE.UU.), y en segundo lugar, dentro de un elemento similar a Tn2/3 en un fondo similar al plásmido-12 (FJ223605, 2005, EE.UU.).

En el primer caso, se identificaron similitudes genéticas entre el plásmido-9, pKPC-FCF/3SP, pKPC-FCF13/05, pCF8698, pKP1433 (que representa un IncN híbrido) y los plásmidos bla KPC de los aislados ecol_516, ecol_517, ecol_656 y ecol_736 (este estudio). El plásmido 9 contiene elementos Tn4401b duplicados en orientación inversa con cuatro secuencias flanqueantes diferentes de 5 pb en una disposición atípica dentro de un intrón del grupo II35. Las estructuras de los otros plásmidos de este grupo son consistentes con un evento separado de adquisición de un elemento Tn4401b entre las regiones pld y traG dentro de una versión ancestral de la estructura del plásmido-9, con la generación de una duplicación del sitio objetivo TTCAG (TSD) flanqueante (etiquetado como plásmido 9-like (hipotético), Fig. 2). La propagación internacional seguida de la evolución local, tanto dentro de las especies como entre ellas, explicaría las diferencias entre los plásmidos, incluyendo (i) variación a nivel de nucleótidos (observada en todos los plásmidos); (ii) pequeños eventos de inserción/deleción (observados en todos los plásmidos); (iii) eventos de inserción/deleción más grandes mediados por elementos transponibles (por ejemplo, pCF8698_KPC_2); y (iv) probable recombinación homóloga, que da lugar a una variación agrupada dentro de un esqueleto de plásmido similar (por ejemplo ecol_656/ecol_736), así como reordenamientos más distintos, incluyendo la formación de plásmidos «híbridos» (por ejemplo, pKP1433)(Fig. 2).

Esquema de comparación de plásmidos IncN similares a FJ223607 (similares al plásmido 9) (disponibles públicamente; este estudio), y su origen geográfico/fechas de aislamiento. Los nombres de las secuencias de plásmidos en rojo son los de este estudio, derivados de los datos de PacBio y las estructuras de plásmidos cerradas (ecol_517, ecol_656) o incompletas (ecol_516, ecol_736) derivadas de los datos de Illumina. Las barras alineadas adyacentes a los nombres de los plásmidos representan las secuencias de los plásmidos: el gris claro denota las regiones con un 100% de identidad de secuencia; el negro representa la diversidad de nucleótidos entre las secuencias; y las líneas finas representan los indels. Las secuencias codificantes están representadas por flechas gordas debajo de las barras de secuencias individuales y están codificadas por colores según la clave de colores. El esquema del recuadro que describe la variación genética entre secuencias muestra ejemplos de eventos evolutivos identificados: (a) cambio a nivel de un solo nucleótido, (b) indels pequeños (≤100 pb), (c) indels grandes (>100 pb), (d) eventos de recombinación.

En el plásmido-12 (FJ223605), Tn4401b se ha insertado en un elemento híbrido de tipo Tn2-Tn3 (con genes de resistencia a fármacos asociados, incluyendo bla TEM-1, bla OXA-9 y varios genes de resistencia a aminoglucósidos), aunque en ausencia de duplicación de la secuencia diana, posiblemente como resultado de un evento de transposición intramolecular y replicativo que genera secuencias del sitio diana no coincidentes (L TSS = TATTA; R TSS = GTTCT). Este complejo se encuentra a su vez entre dos elementos IS15DIV (IS15Δ)/IS26 flanqueados por repeticiones invertidas de 8 pb, y localizados entre los loci traI (891 pb desde el extremo 3′) y pld (~28 Kb; Fig. 3A). Los componentes de la columna vertebral del plásmido IncN-12 coinciden con los observados en un brote del NIH5 y en una versión reordenada en un brote de la Universidad de Virginia (CAV1043; 2008)6. A partir de este estudio, los plásmidos de ecol_224, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_422, y los andamios de ecol_AZ151, ecol_744, ecol_AZ150 comparten estructuras casi idénticas a las del plásmido-12, con una variación agrupada a nivel de nucleótidos presente en los genes traJ-traI, consistente con un evento de recombinación homóloga que afecta a esta región, y evidencia de eventos esporádicos de inserción/deleción (Fig. 3A). Sin embargo, las estructuras de bla KPC-Tn4401 en estos aislados están casi totalmente degradadas por la presencia de otros elementos genéticos móviles (MGEs), incluyendo elementos similares a Tn2/Tn3, ISKpn8/27 y Tn1721. En ecol_224, bla KPC-2 se ha insertado en la espina dorsal de IncN como parte de dos estructuras repetidas e invertidas similares a Tn3, flanqueadas por un TSD TTGCT, y más cerca de traI (136 pb desde el extremo 3′) que el mencionado complejo IS15DIV (IS15Δ)/IS26 en el plásmido-12 (Fig. 3B). Aunque no es posible trazar con precisión la historia evolutiva de esta región genómica dados los datos disponibles, la presencia de firmas compartidas de esta estructura en ecol_422, ecol_744, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_AZ150 y ecol_AZ151 sugiere una adquisición común, y múltiples reordenamientos posteriores mediados por la presencia del gran número de MGEs que flanquean a bla KPC-2.

Esquema de comparación de los plásmidos IncN KPC similares a FJ223605 (Plasmid-12-like) de este estudio. Panel 3A. Origen geográfico, fechas de aislamiento y alineación general de las estructuras del plásmido/contig. Los nombres de las secuencias de plásmidos en rojo son los de este estudio, derivados de los datos de PacBio y las estructuras de plásmidos cerradas (ecol_224, ecol_422, ecol_881, ecol_AZ159) o incompletas (ecol_744, ecol_AZ151, ecol_AZ150) derivadas de los datos de Illumina. Las barras alineadas adyacentes a los nombres de los plásmidos representan las secuencias de los plásmidos: el gris claro denota las regiones con un 100% de homología de secuencia; el negro representa la diversidad de nucleótidos entre las secuencias; y las líneas finas representan los indels. Las secuencias codificantes están representadas por flechas gordas debajo de las barras de secuencias individuales y están codificadas por colores según la clave de colores. El esquema del recuadro que describe la variación genética entre secuencias muestra ejemplos de eventos evolutivos identificados: (a) cambio a nivel de un solo nucleótido, (b) indels pequeños (≤100 pb), (c) indels grandes (>100 pb), (d) eventos de recombinación. Panel 3B. Detalle de la región entre traI y pld que contiene bla KPC-2 sólo en los aislados del estudio. Las secuencias de codificación están codificadas por colores como en la Fig. 3A; las regiones de la secuencia a las que se hace referencia en el texto están anotadas.

Los plásmidos tipo col pueden representar un importante vector de transmisión de bla KPC en E. coli

Los pequeños plásmidos de tipo col fueron el segundo tipo más común de plásmido portador de bla KPC en E. coli (n = 5 ), pero tres de ellos eran idénticos (bla KPC-2, 16.559 pb), todos ellos aislados en Pittsburgh, EE.UU., a partir de aislados de ST131 durante un periodo de dos años (ecol_276 , ecol_356 , ecol_875 ). Estos tres aislados contenían además replicones FIA, FIB, FII, X3 y X4, lo que sugiere la persistencia estable de una cepa clonal + plásmidos a lo largo del tiempo, en consonancia con los análisis de SNV/núcleo y del genoma accesorio (Fig. 1, Figura S1).

Los otros dos plásmidos de tipo col representan efectivamente tramos cortos de ADN que codifican diferentes genes de movilización (mbeA/mbeC/mbeD) unidos a los módulos KPC de Tn4401/bla. Las secuencias de 5 pb que flanquean a Tn4401 son coherentes con la transposición directa e intermolecular en ambos casos (ecol_870: TGTTT-TGTTT; ecol_867: TGTGA-TGTGA). En este conjunto de datos también se observó un plásmido de cointegración col/repA (ecol_AZ161), en el que Tn4401b se insertó entre las secuencias características de colE3 y un elemento Tn3 (Tn4401 TSS: AGATA-GTTCT). La formación de tales estructuras plasmídicas cointegradas en E. coli también se ha descrito previamente36, incluyendo la de una estructura de plásmido fusionado col/pKpQIL (pKpQIL se ha asociado históricamente con bla KPC)37.

Los plásmidos tipo col se han asociado con productores de KPC en otros estudios regionales más pequeños21, 38. Se ha demostrado que estos pequeños vectores son responsables de la difusión entre especies de los genes qnr que median la resistencia a las fluoroquinolonas, incluso en ausencia de cualquier presión de selección antimicrobiana evidente39. La asociación significativa de los plásmidos tipo col con determinadas ST de E. coli (predominantemente ST131) en este estudio podría ser una explicación para la representación desproporcionada de bla KPC en este linaje.

Las diversas secuencias del sitio objetivo (TSS) de Tn4401 de 5 pb apoyan la alta movilidad del transposón

Se observaron isoformas completas de Tn4401 flanqueando a bla KPC-2 o bla KPC-3 en sólo 24/43 (56%) aislados, incluyendo Tn4401a/a-like (n = 10; un aislado con una rotura de contig aguas arriba de bla KPC), Tn4401b (n = 12) y Tn4401d (n = 2). Se identificaron once pares diferentes de secuencias de sitios objetivo (TSS) de 5 pb, de los cuales 7 (64%) no se observaron en ningún plásmido de comparación descargado de GenBank (Tabla S5). Tn4401a tenía tres TSSs de 5 pb diferentes, Tn4401b siete y Tn4401d uno. La mayoría representaba TSDs, pero en tres casos había diferentes TSSs de 5 pb flanqueando a Tn4401, lo que es consistente con eventos de transposición directa inter y replicativa intramolecular.

Del conjunto completo de plásmidos de GenBank y de los experimentos de transposición in vitro llevados a cabo por otros, se han caracterizado 30 tipos diferentes de pares de TSS de 5 pb, siete sólo en el ámbito experimental40. Los plásmidos descargados provienen de una gama de especies y puntos de tiempo (2005-2014), aunque pueden sub-representar una mayor diversidad de sitios de inserción Tn4401 como resultado de los sesgos de muestreo. Sin embargo, nuestros datos serían consistentes con una movilidad significativa de Tn4401 dentro de E. coli tras la adquisición de diversas isoformas de Tn4401 y/o representan múltiples eventos de importación en E. coli desde otras especies.

La asociación tradicional de bla KPC con Tn4401 se ha erosionado significativamente en los plásmidos de KPC en E. coli

En particular, en los otros 19/43 (44%) aislados la estructura de Tn4401 se había degradado mediante su sustitución por MGEs, de los cuales sólo algunos han sido descritos previamente41, 42. Dos aislados tenían estructuras Tn4401Δb nuevas (truncamientos aguas arriba por IS26 o IS26-ΔIS5075 ). Una estructura similar a la de Tn4401e (deleción de 255 pb aguas arriba de bla KPC) estaba presente en tres aislados (ecol_227, ecol_316, ecol_583): esto se caracterizó además en un ensamblaje completo de plásmido PacBio (ecol_316) y representaba un reordenamiento en el sitio del TSS L del elemento ISKpn7. En este plásmido, un segundo elemento Tn4401 parcial estaba presente sin bla KPC, lo que sería consistente con un evento de transposición incompleta, replicativa e intramolecular (GGGAA = L TSS y R TSS en los dos elementos Tn4401b, en orientación inversa). Otros motivos que flanquean a bla KPC son elementos híbridos Tn2/Tn3-ISKpn8/27-bla KPC (n = 1; ecol_224); IS26-ΔtnpR(Tn3)-ISKpn8/27- bla KPC-ΔTn1721-IS26 (n = 5; ecol_AZ153-AZ155, ecol_AZ166, ecol_AZ167); ISApu2-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC- korC-klcA-ΔTn1721-IS26 (n = 1; ecol_542); IS26-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC-korC-IS26 (n = 1; ecol_545); elementos híbridos Tn2/Tn3 + ΔblaTEM-bla KPC-ΔTn1721 (n = 2; ecol_744, ecol_422), elementos Tn3-Δbla TEM-bla KPC- ΔTn1721 (n = 4; ecol_881, ecol_AZ151, ecol_AZ159, ecol_AZ150) y ΔTn3-Δ -ΔIS3000 (Tn3-like) (n = 1; ecol_AZ152). No pudimos evaluar el contexto de flanqueo de bla KPC en ecol_452 debido a las limitaciones del ensamblaje.

Esta aparente diversidad en MGEs adquiridos independientemente alrededor del gen bla KPC amplía los medios por los que bla KPC puede ser movilizado. Curiosamente, como se observó anteriormente43, todas las secuencias degradadas de Tn4401 en este conjunto de datos estaban asociadas con tramos variables de secuencias similares a Tn2/3, lo que sugiere que la inserción de Tn4401 en un contexto similar a Tn2/Tn3 puede haber permitido que este último actúe como un punto caliente para la inserción de otros MGEs6. Un hallazgo particular es la asociación con IS26, que se ha vinculado a la diseminación de varios otros genes de resistencia en E. coli, incluidos los ESBL de CTX-M24, 44; es capaz de aumentar la expresión de genes de resistencia estrechamente ubicados45; participa en la formación de cointegrados y, por tanto, en el reordenamiento del plásmido46; y aumenta la aparición de otros eventos de transferencia mediados por IS26 en plásmidos que albergan IS26 46.