7.2 Arquitectura testicular

Lue et al. (2005, 2010a) informaron de que los ratones 41,XXY adultos tenían testículos pequeños y firmes que contenían túbulos SCO de diámetro reducido con un mayor número de células de Leydig en el intersticio. Estos hallazgos son idénticos a los del modelo alternativo de SK, el ratón 41,XXY* (Lewejohann et al., 2009a; Wistuba et al., 2010, Fig. 24.2) y se asemejan perfectamente al fenotipo testicular observado en la gran mayoría de los hombres adultos con SK (Fig. 24.3). Además, los ratones 41,XXY mostraron un patrón aberrante de expresión del receptor de andrógenos (AR), no observado hasta ahora en el SK (Lue et al., 2005).

Figura 24.2. Fenotipo testicular del modelo de ratón 41,XXY* del SK.

(A) Hibridación in situ con fluorescencia (FISH) de los cromosomas sexuales en núcleos interfásicos obtenidos de muestras de sangre periférica de ratones macho de la cepa B6Ei.Lt-Y*. Lado izquierdo: núcleos de leucocitos de ratones macho 40,XY*, lado derecho: núcleos de leucocitos de ratones macho 41,XXY*. (a) Cromosomas Y* (puntas de flecha) detectados por la sonda verde fluorescente específica de ratón; (b) cromosoma X (flechas) detectado por la sonda roja fluorescente específica de ratón; (c) tinción nuclear DAPI; (d) superposición de a-c. Nótese las dos señales del cromosoma X en los leucocitos 41,XXY*. Un cromosoma X está siempre situado en estrecha asociación con la señal Y*. El solapamiento parcial de estos cromosomas puede detectarse por el color amarillento. (B) Comparación de los pesos bitesticulares entre los varones adultos 41,XXY* (n = 98) y sus controles de camada 40,XY* (n = 91). La pérdida de células germinales en los machos con un cromosoma X supernumerario dio lugar a una reducción significativa del tamaño de los testículos. Los valores son la media ± SEM. (C y D) Micrografías representativas de la histología testicular del epitelio seminífero. (C) Ratón de control 40,XY* con espermatogénesis completa. (D) Testículo de ratón 41,XXY*. Todas las células germinales fueron eliminadas del epitelio seminífero dejando el síndrome de las células de Sertoli solamente. Las células de Sertoli muestran el comienzo de la vacuolización. (E y F) Micrografías representativas de la histología testicular del espacio intersticial. (E) En los ratones control 40,XY* las células de Leydig se disponen normalmente en los espacios intersticiales entre las paredes tubulares. (F) En cambio, en los ratones 41,XXY*, el número de células de Leydig está aumentado, formando una hiperplasia. Las barras representan 20 μm. Símbolos: X, células de Sertoli; *, células germinales diferenciadas; #, células de Leydig. Tinción: Hematoxilina-Eosina.

Figura 24.3. Histología del tejido testicular humano: Comparación de la espermatogénesis normal y el síndrome de SCO típicamente observado en los pacientes de Klinefelter.

(A, C y E) Micrografías representativas de la histología testicular humana normal que muestra una espermatogénesis completa. (B, D y F) Micrografías representativas de la histología testicular de un paciente con síndrome de SCO. (A y B) Vista general de los cortes transversales tubulares: mientras que el tejido de control muestra una distribución normal de las áreas intersticiales y tubulares, la situación de SCO exhibe una pérdida completa de células germinales y paredes tubulares hialinizadas. Los túbulos seminíferos sólo contienen células de Sertoli. (C y D) Detalle del epitelio seminífero: En el control, están presentes todos los estadios de las células germinales hasta los espermatozoides maduros. Típicamente, en los hombres adultos con SK, faltan todas las células germinales. Las células de Sertoli muestran el comienzo de la vacuolización. (E y F) Detalle del espacio intersticial. En el testículo de control, las células de Leydig se disponen normalmente en los espacios intersticiales entre las paredes tubulares. En cambio, en el tejido obtenido de un paciente con SK, el número de células de Leydig es elevado, mostrando una hiperplasia típica. Las barras representan 20 μm. Símbolos: X, células de Sertoli; *, células germinales diferenciadas; #, células de Leydig. Tinción: Hematoxilina-Eosina.

Las células de Sertoli están situadas en los túbulos seminíferos donde apoyan la diferenciación espermatogénica proporcionando nutrición y mediación de la señalización endocrina (Wistuba et al., 2007). Por ello, cualquier alteración en estas células esenciales influye profundamente en la función testicular. Se han encontrado pruebas de la apoptosis temprana de las células de Sertoli en el SK, lo que lleva a proponer que la pérdida de apoyo y comunicación entre las células de Sertoli y las células germinales podría estar relacionada con el agotamiento de las células germinales observado en el síndrome (Aksglaede et al., 2006; Wistuba et al., 2010). Las células de Sertoli expresan el receptor de andrógenos (AR) y producen la proteína de unión a andrógenos y la inhibina. Por lo tanto, cualquier perturbación de las células podría influir en la cantidad de ITT en los espacios intersticiales y, como consecuencia, afectar a la retroalimentación endocrina a lo largo del eje gonadal hipotálamo-hipófisis. No se pudieron obtener pruebas empíricas sólidas sobre la alteración de la presencia, el desarrollo y/o la función de las células de Sertoli hasta que se dispuso de los primeros hallazgos sistemáticos de los modelos experimentales. Los hallazgos de los primeros estudios (Lue et al., 2005) fueron de especial interés e importancia, ya que mostraron que el RA se expresaba en las células de Sertoli de los ratones XY adultos de control, pero no en los ratones XXY. Esto es así a pesar de que ambos animales tenían un patrón similar hasta el día 20 postparto (pp), lo que indica que la pérdida de expresión del RA en los ratones XXY se produce alrededor de la pubertad y sugiere que en estos animales, la maduración de las células de Sertoli puede estar alterada indicando que pueden influir o ser influenciadas por un desarrollo anormal de las células germinales. Una evaluación histológica de los testículos del modelo 41,XXY*, en la que se encontró que el número de células de Sertoli estaba disminuido en comparación con los controles, dio cierta credibilidad a esta noción.

Las investigaciones realizadas hasta ahora proporcionan pruebas suficientes para suponer que las células de Sertoli están alteradas en los varones con un cromosoma X supernumerario. Para comprender los fundamentos de la interacción de las células germinales de Sertoli, la apoptosis de las células de Sertoli, la maduración y la diferenciación, se necesitan evaluaciones más profundas; estudios que requieren cantidades sustanciales de material y la crónica de la proliferación, la diferenciación y la maduración a lo largo de un amplio período de tiempo. Estas investigaciones son imposibles de realizar en humanos. Sólo con la ayuda de los modelos de ratón se puede llevar a cabo cualquier exploración significativa de los cambios en esta célula testicular somática crucial.

Se informó que durante la degeneración testicular observada en el SK también las células de Sertoli degeneran con el tiempo (Aksglaede y Juul, 2013; Aksglaede et al., 2006), una observación que está en consonancia con los datos de nuestro modelo de ratón que demuestran que el número de células de Sertoli se altera durante el desarrollo postnatal (Werler et al., 2014). En conjunto, la fisiología alterada de las células de Sertoli requiere análisis más detallados de este tipo de células somáticas ya durante el desarrollo prenatal. La propagación y diferenciación de la línea germinal se ve especialmente afectada por las consecuencias de la aberración cromosómica. Así, los principales puntos de control y, en consecuencia, los procesos que tienen lugar específicamente en la línea germinal podrían verse alterados por el desequilibrio cromosómico, es decir, el desarrollo del sistema de células madre primordiales y espermatogonias (PGC, SSC). Como se ha mencionado anteriormente, los estudios in vitro han demostrado que las células germinales indiferenciadas aneuploides morían cuando se aislaban de gónadas embrionarias y sólo las que tenían un cariotipo corregido al azar sobrevivían en cultivo (Hunt et al., 1998; Mroz et al., 1999). Por lo tanto, las CSE con un cariotipo aberrante deben haber entrado en una vía por defecto durante la fase intrauterina pero más tarde en el periodo perinatal. Cuando sólo las células germinales con un cariotipo corregido sobreviven in vitro tras ser aisladas de la gónada embrionaria, mientras que las células germinales aberrantes mueren con el tiempo, surge la pregunta de por qué -en vivo- la pérdida de células germinales progresa postnatalmente como se ha demostrado recientemente (Werler et al., 2014). Incluso si unas pocas células germinales aberrantes siguen presentes en el testículo perinatal, una cierta proporción de las presentes en el momento del nacimiento debería ser de cariotipo correcto y la población de células espermatogoniales debería al menos permanecer estable si no se propaga. A partir de esta observación, en parte contradictoria, y aceptando la hipótesis más plausible de que la corrección por propulsión aleatoria explica la supervivencia de una población reducida de células germinales primordiales (CGP; Mroz et al., 1999; Sciurano et al., 2009) y posteriormente de gonocitos en el periodo postnatal, algunos de esos supervivientes podrían perder sus propiedades de células madre ya antes del nacimiento. Aparentemente se pierden durante la diferenciación peripuberal, mientras que muy pocos pueden sobrevivir ocasionalmente, expresar correctamente todos los marcadores relevantes e impulsar focos de espermatogénesis. La evaluación sistemática de los cambios fenotípicos durante el desarrollo in utero sólo es posible en un modelo de ratón.

La alteración del eje HPG, que causa el hipogonadismo hipergonadotrópico comúnmente observado en los pacientes con SK, junto con el sugerido aumento del número de células de Leydig en las biopsias testiculares, ha llevado a la hipótesis de que la función y/o maduración de las células de Leydig podría verse afectada por el desequilibrio cromosómico sexual. Las células de Leydig son esteroidogénicas, siendo la fuente de testosterona, que es esencial para el desarrollo del fenotipo masculino sano y crucial para la continuación y finalización de la espermatogénesis normal.

Al igual que con las otras facetas del SK, el factor restrictivo para cualquier investigación en profundidad es el acceso limitado al tejido testicular. Con la disponibilidad de los ratones machos 41,XXY*, los estudios sobre las células de Leydig de machos con un cromosoma X supernumerario se hicieron factibles de investigar. Utilizando este modelo confirmamos la presencia de hiperplasia de células de Leydig determinada por microscopía estereológica y también encontramos que los niveles de ITT eran similares a los de los ratones de control (Wistuba et al., 2010). Esto fue sorprendente teniendo en cuenta los bajos niveles séricos de T observados tanto en los pacientes con SK como en los ratones 41,XXY* (Lanfranco et al., 2004; Smyth y Bremner, 1998; Wistuba, 2010). En consonancia con los bajos niveles de T circulante, se descubrió que, una vez que las células de Leydig del modelo de SK se sacaron del entorno testicular, se cultivaron in vitro y se normalizó su número de células, su función estaba efectivamente alterada. Sin embargo, no estaba deteriorada, como cabría pensar en un principio, sino hiperactivada. Cuando los perfiles de expresión del ARNm de los genes marcadores Tsp2 (trombospondina 2: una proteína matricelular de origen fetal que se expresa predominantemente en las células de Leydig juveniles), Rlf (factor similar a la relaxina: marcador de las células de Leydig maduras), Est (estrógeno sulfotransferasa: marcador de células de Leydig maduras), y LHR (receptor de LH: investigado para su correlación con los experimentos de estimulación de las células de Leydig, véase más adelante), las células de Leydig XXY* aisladas mostraron un perfil de expresión de ARNm maduro y una actividad transcripcional significativamente mayor en comparación con los controles (Wistuba et al., 2010; O’Shaughnessy et al., 2002). El análisis de la expresión génica reveló un aumento general de la expresión de los genes específicos de las células de Leydig XXY* con una expresión de Est aproximadamente 20 veces, Rlf 8 veces, Tsp2 5 veces y LHR 3 veces mayor que la de las células de Leydig de tipo salvaje. La estimulación de las células de Leydig XXY* in vitro indicaba un receptor de LH maduro que respondía incluso con más fuerza a la estimulación de la gonadotropina coriónica humana (hCG, un sustituto de la LH) que las células de los controles. Además, la actividad esteroidogénica de las células de Leydig XXY* era elevada, en el sentido de que se producía más T por célula en respuesta a la hCG.

Estos emocionantes resultados no sólo conducen a un nuevo concepto sobre el origen del hipogonadismo hipergonadotrópico, sino que también demuestran la validez del modelo de ratón del SK, con sus consecuencias translacionales directas para nuestra comprensión de los pacientes del SK. Los resultados del modelo de ratón indican que la función de las células de Leydig no está alterada per se, lo que sugiere que otros factores del entorno testicular son responsables de la alteración de la endocrinología androgénica observada en los pacientes con SK. En particular, ya que pudimos confirmar también en los pacientes que los valores de ITT no eran diferentes de los controles (Tüttelmann et al., 2014). Posiblemente, la arquitectura testicular alterada asociada al trastorno puede dificultar el transporte endocrino a la circulación, una proposición que fue apoyada por los hallazgos de que los pacientes con SK también tienen un diámetro de vasos sanguíneos disminuido (Foresta et al., 2012). Teniendo en cuenta esto, nos propusimos encontrar una posible explicación «vascular» para la falta de liberación de T en el flujo sanguíneo testicular. Sin embargo, en las biopsias de testículo de los pacientes no es posible realizar un análisis fiable de los vasos debido al sesgo resultante de la técnica de disección que exige evitar los vasos sanguíneos más grandes para evitar el sangrado. En consecuencia, se evaluó la constitución de los vasos sanguíneos en secciones de testículos enteros de ratones adultos machos 41,XXY* y 40,XY*. De hecho, la relación vasos sanguíneos/superficie testicular que corrige el menor tamaño de los testículos de los ratones XXY* fue significativamente menor en estos ratones en comparación con los controles XY*. En conclusión, la producción testicular de T no parece estar alterada en los hombres con SK. Los datos del modelo de ratón nos permiten especular que un suministro vascular reducido podría estar implicado en una menor liberación de T en el torrente sanguíneo.