ORIGINAL PAPER

Biochemical and pharmacological study of venom of the wolf spider Lycosa singoriensis

Liu ZHI; Qian WII; Li JI; Zhang YI; Liang SI

ICollege of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha, China
IIAdministrative Center for Basic Research, Ministry of Science ant Technology, China

Correspondencia a

ABSTRACT

La araña lobo Lycosa singoriensis es una araña grande y venenosa distribuida por el noroeste de China. Al igual que otros venenos de araña, el de la araña lobo es un cóctel químico. Su contenido en proteínas es de 0,659 mg de proteína/mg de veneno crudo, según el método de Lowry. El análisis MALDI-TOF reveló que los péptidos del veneno son muy diversos y pueden dividirse en tres grupos caracterizados por tres rangos moleculares independientes: de 2.000 a 2.500 Da, de 4.800 a 5.500 Da y de 7.000 a 8.000 Da, respectivamente. Esta distribución molecular difiere sustancialmente de la de la mayoría de los venenos de araña estudiados hasta ahora. El veneno de esta araña lobo tiene una baja acción neurotóxica en ratones, pero puede inducir la hemólisis de los eritrocitos humanos. Además, el veneno muestra actividad antimicrobiana contra células procariotas y eucariotas.

Palabras clave: araña, Lycosa singoriensis, veneno crudo, MALDI-TOF, actividad antimicrobiana.

INTRODUCCIÓN

Hay unas 39.000 especies de arañas descritas, con un número aún mayor pendiente de caracterización. Casi todas las arañas son depredadoras y tienen glándulas venenosas. El objetivo principal de los venenos de las arañas es matar o paralizar a sus presas. Los venenos de las arañas son cócteles químicos complejos en los que los péptidos son los principales constituyentes de la mayoría de los venenos de las arañas, excepto los de la araña viuda negra, que contienen una elevada proporción, superior a las proteínas de 100 kD (1-3). Los péptidos del veneno de araña se producen de forma combinada, lo que da lugar a un total estimado de alrededor de 1,5 millones de péptidos de veneno de araña. En consecuencia, los venenos de araña son una rica fuente de nuevos compuestos de interés farmacológico y agroquímico que han recibido una mayor atención por parte de farmacólogos y bioquímicos en los últimos años. Sin embargo, en las últimas décadas sólo se han estudiado con suficiente detalle unos pocos venenos de araña, por lo que hasta ahora se han identificado menos del 0,01% de los péptidos de veneno de araña (4-7).

La araña lobo Lycosa singoriensis es una araña de gran tamaño distribuida por el noroeste de China. La araña hembra adulta tiene una longitud corporal de 28 a 40 mm (35±6 mm) y un peso corporal de 2,6 a 7 g (Figura 1). Esta araña peluda vive en agujeros bajo tierra. Su madriguera, forrada con un tubo de seda, tiene un diámetro de 2 a 4 cm y una longitud de 30 a 60 cm, y la entrada de la madriguera suele estar cubierta con una red de seda. La araña pasa el día acurrucada en el fondo del agujero, mientras que asciende por el tubo de seda y se esconde cerca de la entrada de la madriguera a la espera de sus presas por la noche. Tras conseguir atrapar a sus víctimas, la araña las introduce en el agujero. En muchos casos, en el fondo de la madriguera se encuentran residuos de pequeños insectos. La araña lobo Lycosa singoriensis es también una araña venenosa y agresiva. En el año 2000 se registraron mordeduras de araña lobo a personas y otros animales en la zona norte de la provincia de Xinjiang. Según los registros clínicos, la mayoría de las mordeduras de araña causaron efectos aparentes, incluyendo marcas rojas y dolor alrededor de los lugares de la mordedura (8, 9).

En este estudio, informamos de las propiedades bioquímicas y farmacológicas del veneno de la araña lobo Lycosa singoriensis. En comparación con muchos otros venenos de araña estudiados hasta ahora, el veneno de esta araña tiene algunas propiedades distintas, lo que lo convierte en una fuente útil para el cribado de fármacos y para el estudio de la biodiversidad de los péptidos del veneno de araña.

MATERIALES Y MÉTODOS

Recogida de arañas y veneno

Las hembras adultas de la araña Lycosa singoriensis se recogieron en la provincia de Xinjiang, China, se mantuvieron en cubos de plástico cubiertos con redes de plástico y se les dio agua diariamente. Se utilizaron hígados de cerdo picados y gusanos para alimentarlas. Como muchas otras arañas de gran tamaño (10, 7), la Lycosa singoriensis se vuelve fácilmente agresiva cuando es provocada por un trozo de tubo de plástico. Agarran el tubo con fuerza, y entonces sus colmillos venenosos perforan el tubo e inyectan veneno en su interior. Esto evita la necesidad de estimulación eléctrica, que puede contaminar el veneno con las enzimas de la saliva y los fluidos digestivos. Con este método se pueden obtener unos 50 mg de veneno de aproximadamente 300 arañas Lycosa singoriensis, lo que permite explorar las propiedades bioquímicas y farmacológicas del veneno de esta araña. El veneno crudo es un líquido claro e incoloro, fácilmente soluble en agua, y se recogió cada dos semanas. El veneno crudo liofilizado se almacenó a -20°C antes del análisis.

Análisis de SDS-PAGE del veneno crudo

La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) del veneno recogido se realizó en condiciones desnaturalizadas en un gel de poliacrilamida al 10%. Se utilizaron cien microgramos de veneno liofilizado para la electroforesis, y las proteínas separadas en el gel se visualizaron mediante tinción G250.

Análisis MALDI-TOF del veneno crudo

La huella dactilar del veneno crudo se determinó utilizando una espectrometría de masas de desorción láser asistida por matriz/ionización-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) (estación de trabajo Voyager-DE STR Biospectometry®, Applied Biosystems, USA). La ionización se logró mediante la irradiación con un láser de nitrógeno (337 nm) a una tensión de aceleración de 20 kV; se empleó como matriz el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CCA).

El efecto del veneno crudo sobre preparaciones de sinapsis nerviosas aisladas

Se utilizaron tres tipos de preparaciones de sinapsis nerviosas aisladas – nervio frénico-diafragma de ratón, conducto deferente de rata y corazón de sapo – para investigar la actividad farmacológica del veneno crudo. Los experimentos de preparación del nervio frénico-diafragma de ratón se llevaron a cabo según Bülbring (11). Los ensayos del conducto deferente y del corazón de sapo se realizaron de acuerdo con Liang et al. (12).

Ensayo hemolítico

La actividad hemolítica del veneno crudo se ensayó con glóbulos rojos humanos heparinizados enjuagados tres veces en 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS – 50 mM NaH2PO4 y 150 mM NaCl, pH 7,2) y centrifugados durante 5 minutos a 3.000 rpm. A continuación, los glóbulos rojos se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en agua desionizada (control positivo), en PBS (blanco) o con venenos a distintas concentraciones (de 3,1 a 20 mg/mL) en PBS. Las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se separó del pellet y se midió su absorbancia a 570 nm.

Actividad antimicrobiana del veneno crudo

Seis bacterias (Bacillus cereus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus albus y E. coli DH5) y dos hongos (Saccaromyces cerevisae y Candida albicans) se cultivaron respectivamente en el medio de cultivo hasta alcanzar la fase exponencial con una absorbencia a 600 nm de 0,3 a 0,8. Se extendieron 50 microlitros de medio de manera uniforme en tres placas de agar solidificado. Las placas se completaron con agarosa/medio al 1,5% y se vertieron en placas de Petri estériles de 100 × 20 mm. Un papel de filtro de 6 mm de diámetro cubrió las placas. En el papel de filtro se colocaron cinco microlitros de solución de veneno, en solución salina normal, a varias concentraciones. Después de la incubación a 37°C durante la noche, los efectos del veneno crudo se registraron como círculos claros en el césped bacteriano en el papel de filtro.

Por lo tanto, en este bioensayo, las soluciones de veneno crudo en varias concentraciones (3 mg/mL, 6 mg/mL y 12 mg/mL) se dejaron caer en el papel de filtro, y un círculo claro fue detectable en el papel si el veneno en esta concentración había inhibido el crecimiento microbiano.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterización bioquímica del veneno crudo

Se encontró que cada miligramo de veneno crudo contiene aproximadamente 0,659 mg de proteínas/péptidos. Como se muestra en la Figura 2, las proteínas de alta masa molecular del veneno crudo se distribuyen principalmente entre las masas moleculares que van de 14 a 31.000 Da, con una banda de proteína gruesa cerca de 20.000 Da y otra banda evidente cerca de 14.000 Da. También es visible una banda gruesa en la parte superior del panel del gel SDS-PAGE que consiste en los péptidos con masas moleculares inferiores a 10.000 Da. Las proteínas/péptidos distribuidos en las dos bandas gruesas son los componentes más abundantes del veneno crudo, que corresponden al 80% del componente proteico del veneno crudo.

Recientemente, se aplicó la espectrometría de masas MALDI-TOF para dilucidar la complejidad de los péptidos del veneno. Además, con el rápido desarrollo de la espectrometría de masas, esta tecnología se ha utilizado ampliamente en la investigación del veneno (5, 13). Por ejemplo, Pierre Escoubas et al. (5) pintaron un cuadro de veneno para conceptualizar la complejidad de los venenos de las arañas de tela de embudo australianas utilizando un enfoque combinado de ADNc y espectrometría de masas. Sus estudios demuestran que los venenos de estas arañas contienen muchos cientos de péptidos que siguen una distribución bimodal, con la mayoría de los péptidos en el rango de masa de 3.000 a 5.000 Da, y un segundo grupo menos pronunciado en el rango de 6.500 a 8.500 Da. Esta distribución de masas moleculares es análoga a la observada anteriormente en un gran número de venenos de tarántulas (4). También se encontraron resultados similares en nuestros estudios anteriores de los venenos de las arañas tarántulas chinas Ornithoctonus huwena, Ornithoctonus hainana y Chilobrachys jingzhao (14-16).

Como se presenta en la figura 3, el análisis de espectrometría MALDI-TOF del veneno crudo de Lycosa singoriensis demuestra que la distribución de la masa molecular se observa de forma análoga en el rango de 1.000 a 10.000 Da. Sin embargo, a diferencia de las especies mencionadas, los péptidos del veneno de Lycosa singoriensis pueden dividirse en tres grupos según sus masas. El primer grupo comprende péptidos que poseen masas moleculares entre 2.000 y 2.500 Da, lo que indica que tienen unos 20 residuos de aminoácidos. Este rango de masas moleculares rara vez se ha observado en la mayoría de los venenos de araña estudiados hasta la fecha. El segundo grupo incluye principalmente péptidos con masas moleculares en el rango de 4.800 a 5.500 Da, lo que sugiere que están compuestos por unos 50 residuos de aminoácidos. El tercer grupo está formado por péptidos cuya masa oscila entre 7.000 y 8.000 Da, lo que corresponde a más de 60 residuos de aminoácidos. Se estima que los péptidos distribuidos en los dos últimos grupos son la mayoría de los péptidos del veneno.

Interesantemente, más bien pocos péptidos tienen masas moleculares entre 3.000 y 5.000 Da. Paradójicamente, los péptidos de este rango de masa son el componente más abundante en muchos otros venenos de araña. Serían necesarios más estudios para dilucidar estas discrepancias, que podrían contribuir a entender el mecanismo evolutivo de los péptidos de los venenos de araña. El presente estudio contribuye a demostrar que los péptidos de Lycosa singoriensis son muy diversos.

El análisis de las bibliotecas de ADNc de la glándula del veneno produjo más de 200 secuencias de péptidos similares a las toxinas. La distribución de masas de estos péptidos derivados de las secuencias de ADNc coincide con la observada por espectrometría MALDI-TOF. Además, el análisis de las secuencias reveló que los péptidos del primer grupo no tienen residuos de cisteína, y los del segundo grupo contienen 4 o 5 enlaces disulfuro, mientras que los del último grupo tienen más de 5 enlaces disulfuro (datos no publicados). La mayoría de las toxinas peptídicas de araña identificadas hasta ahora suelen tener 3 o 4 enlaces disulfuro, y sus estructuras 3D adoptan el clásico motivo de nudo de cistina del inhibidor. En consecuencia, hay razones para creer que algunos péptidos del veneno de Lycosa singoriensis poseerían un tema estructural novedoso.

Caracterización farmacológica del veneno crudo

El veneno crudo, a una dosis alta de 200 µg/mL, no pudo bloquear la contracción estimulada eléctricamente de la preparación del diafragma del nervio frénico del ratón (n = 5). También mostró un bajo efecto en la respuesta de contracción del conducto deferente de rata. La concentración de 200 µg/mL de veneno crudo sólo pudo inhibir parcialmente la respuesta de contracción durante 20 minutos (n = 5) (Figura 4 – A). Por el contrario, el veneno crudo de la araña O. huwena, a la misma concentración, fue capaz de bloquear rápidamente la respuesta de contracción de la misma preparación de nervio-diafragma o del conducto deferente de rata (datos no mostrados). Sin embargo, el veneno crudo de Lycosa singoriensis tuvo un efecto significativo sobre la contracción del corazón del sapo. En presencia de 100 µg/mL de veneno crudo, la tasa y la magnitud de los latidos del corazón aumentaron potentemente (n = 5) (Figura 4 – B). Esto sugiere que el veneno crudo contiene algunos compuestos que son cardiotónicos.

Actualmente, los agentes cardiotónicos se clasifican en tres clases basadas en sus mecanismos de acción subcelular, a saber, agentes que actúan a través de mecanismos ascendentes (movilizadores de Ca2+), así como mecanismos centrales y descendentes (sensibilizadores de Ca2+). Estos agentes inducen un efecto inotrópico positivo al elevar la concentración intracelular de iones Ca2+ (17). Hasta la fecha, no se ha informado de un efecto cardiotónico de los venenos de la araña lobo, mientras que todavía no se han purificado y caracterizado los compuestos cardiotónicos de estos venenos. Por lo tanto, es importante investigar los compuestos cardiotónicos del veneno de Lycosa singoriensis.

La actividad hemolítica del veneno crudo se determinó utilizando eritrocitos humanos frescos. Como se muestra en la Figura 5 (A), el veneno crudo interrumpió los eritrocitos humanos de manera dependiente de la dosis. Su valor de concentración efectiva de inhibición del 50% (EC50) es de 1,25 mg/mL.

Según informaron Budnik et al. (18), el veneno crudo de Lycosa singoriensis contiene péptidos antimicrobianos (denominados licocitinas 1, 2 y 3) que pueden inhibir el crecimiento de bacterias y hongos grampositivos y gramnegativos a concentraciones micromolares. Por lo tanto, probamos la actividad antimicrobiana del veneno crudo contra células procariotas y eucariotas mediante el ensayo de inhibición del crecimiento en placa. En nuestras condiciones de bioensayo, las cepas celulares más sensibles al veneno crudo fueron, concretamente, Bacillus subtilis y Staphylococcus sp, en las que el crecimiento se inhibió potentemente a 3 mg/mL. El veneno también actuó fuertemente contra Corynebacterium glutamicum y Micrococcus luteus, pero débilmente contra una de las cepas de hongos (Candida albicans). Sin embargo, el veneno crudo no tuvo ningún efecto detectable sobre E. coli y Saccaromyces cerevisae incluso a la alta concentración de 12 mg/mL (Figura 5 – B).

Durante los últimos diez años, se han identificado muchos péptidos antimicrobianos a partir de venenos de arañas. Las licotoxinas I y II fueron identificadas a partir del veneno de la araña lobo Lycosa carolinensis. Ambos son péptidos antimicrobianos lineales que muestran el carácter anfipático α-hélice típico de los péptidos formadores de poros. Su mecanismo de formación de poros se verificó además al promover el flujo de iones de calcio desde los sinaptosomas (19). Después de las licotoxinas, también se descubrió que las cupienninas (20-22) y las oxipininas (23, 24), procedentes del veneno de las arañas lobo Cupiennus salei y Oxyopes kitabensis, respectivamente, tenían actividades antimicrobianas. Más recientemente, se purificaron siete nuevos péptidos lineales antimicrobianos y citolíticos llamados latarcinas a partir del veneno de la araña Lachesana tarabaevi. Además, se predijeron cinco nuevos péptidos que comparten una considerable similitud estructural con las latarcinas purificadas a partir de la base de datos de la etiqueta de secuencia expresada para la glándula del veneno de la araña (25).

Estos péptidos de los venenos de araña pertenecen a los péptidos antimicrobianos lineales catiónicos α-helicos. Esta clase de péptidos antimicrobianos comparte algunas características comunes, como la inhibición del crecimiento microbiano a bajas concentraciones micromolares y la formación de hélices anfipáticas y catiónicas en entornos hidrofóbicos. Durante las últimas décadas, se ha descubierto un gran número de péptidos antimicrobianos, incluidos los péptidos antimicrobianos catiónicos lineales α-helicoidales, tanto en animales como en plantas. Estos péptidos suelen estar compuestos por entre 12 y 45 aminoácidos, y desempeñan importantes funciones en los sistemas inmunitarios innatos de la mayoría de los organismos vivos (26-28). La mayoría de ellos pueden matar microorganismos con las siguientes cuatro características: toxicidad selectiva, muerte rápida, amplio espectro antimicrobiano y ausencia de desarrollo de resistencia (29-31).

En resumen, informamos de nuevos hallazgos bioquímicos y farmacológicos sobre el veneno de la araña lobo Lycosa singoriensis. Las distintas propiedades de los péptidos de este veneno lo convierten en un modelo ideal para estudiar los mecanismos evolutivos de los péptidos del veneno de las arañas. El estudio farmacológico de este veneno es útil para la purificación y caracterización de los péptidos bioactivos en estudios posteriores.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por los proyectos de la National Science Foundation (30430170 y 30700127).

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