Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de células madre embrionarias humanas: Tendencias y retos actuales
Abstract
Las células madre embrionarias humanas (hESCs) tienen un gran potencial para el tratamiento de diversas enfermedades degenerativas. Las hESCs pluripotentes tienen una gran capacidad de autorrenovación ilimitada en cultivo y de diferenciarse en todos los tipos celulares del organismo. El camino de la investigación con hESCs no es tan sencillo, ya que se ha enfrentado a varios retos que se limitan no sólo a la formación de tumores y al inmunorrechazo, sino también a aspectos sociales, éticos y políticos. El aislamiento de hESCs a partir del embrión humano se considera altamente objetable ya que requiere la destrucción del embrión humano. La cuestión se debatió y discutió tanto en plataformas públicas como gubernamentales, lo que llevó a la prohibición de la investigación con hESC en muchos países del mundo. La prohibición ha afectado negativamente al progreso de la investigación con hESCs, ya que muchos gobiernos federales de todo el mundo dejaron de financiar la investigación. Posteriormente, algunos países levantaron la prohibición y permitieron la financiación de la investigación con hESC, pero el daño ya se ha producido en el progreso de la investigación. Bajo estas condiciones desfavorables, todavía se hicieron algunos progresos para aislar, cultivar y caracterizar las hESCs utilizando diferentes estrategias. En esta revisión, hemos resumido varias estrategias utilizadas para aislar, cultivar y caracterizar con éxito las hESCs. Finalmente, las hESCs son muy prometedoras para las aplicaciones clínicas con estrategias adecuadas para minimizar la formación de teratomas y la inmunorrecepción y mejores estrategias de trasplante celular.
1. Células madre embrionarias: Descubrimiento temprano y procedimiento de aislamiento
Las células madre embrionarias (CME) se aislaron por primera vez de embriones de ratón en 1981, y la palabra «célula madre embrionaria» fue acuñada por primera vez por Gail R. Martin. Sin embargo, el mundo conoció las CME con el gran descubrimiento de 1998, en el que Thomson y su equipo mostraron por primera vez una técnica para aislar las hESC a partir de embriones humanos. A partir de entonces, los investigadores han demostrado que las hESCs tienen la capacidad de diferenciarse en todas las células del cuerpo, incluidas las células beta de los islotes de Langerhans , las células neuronales , los cardiomiocitos y las células similares a los hepatocitos . Las capacidades pluripotenciales de las hESCs han dado esperanza a millones de pacientes que sufren de diabetes, enfermedad de Parkinson, enfermedades cardiovasculares y hepáticas. Teniendo en cuenta que las hESC tienen un gran potencial terapéutico, se han generado varias líneas de hESC en todo el mundo. Uno de los retos de las hESCs era el método de aislamiento de las células madre del embrión humano, ya que las hESCs sólo pueden obtenerse de la masa celular interna (MCI) de los embriones humanos . Los investigadores informaron de que la MCI puede obtenerse de embriones humanos frescos o congelados. Posteriormente, se desarrollaron varios métodos para aislar la MCI de un solo embrión humano, que incluyen la disección mecánica, en la que la MCI se aísla mediante presión mecánica . La MCI también se puede aislar mediante la disección con láser y mediante procedimientos de inmunocirugía. El uso de un procedimiento de inmunocirugía para aislar la MCI tiene varias ventajas, pero también conlleva algunas desventajas. Por ejemplo, el procedimiento de inmunocirugía requiere medios de cultivo que contienen suero de cobaya; por lo tanto, el uso de suero animal hace que la técnica de inmunocirugía no sea adecuada para la generación de líneas de hESC de grado clínico. En otro método, se pueden aislar líneas de hESC a partir de MCI mediante la microdisección de blastocistos humanos con agujas finas. La biopsia asistida por láser es también la técnica más prometedora para el aislamiento de la MCI sin xenos. Tras el aislamiento de la MCI, las células madre se cultivan para generar las CME utilizando capas alimentadoras, matrices extracelulares, proteínas, péptidos y polímeros sintéticos . Las ventajas y desventajas de los distintos métodos de aislamiento de MCI se resumen en la Tabla 1.
|
|||||||||||||||||||||||||||
El aislamiento de la MCI requiere la destrucción de embriones humanos, lo que ha planteado graves problemas éticos. Para satisfacer la cuestión ética, los investigadores demostraron un enfoque alternativo para aislar hESCs de un solo blastómero sin matar o destruir el embrión humano. Por ejemplo, durante las pruebas genéticas de preimplantación, se puede obtener una biopsia de embrión con un solo blastómero de los pacientes (; Klimanskaya et al., 2009). Se ha informado de que se han obtenido con éxito 5 líneas de hESC a partir de una única biopsia de blastómero. El éxito en la obtención de hESCs de buena calidad depende de la calidad de los blastocistos y de los procedimientos de aislamiento y condiciones de cultivo. Se informó de que se obtuvieron 2 líneas de hESC a partir de 4 blastocistos, mientras que sólo se pudieron aislar 3 líneas de hESC a partir de 13 blastocistos y, en algunos casos, sólo se pudieron aislar 3 líneas de hESC a partir de 58 blastocistos . Estas diferencias en el aislamiento de líneas hESC a partir de diferentes blastocistos se deben principalmente a la calidad de los embriones y también dependen del método de aislamiento de los embriones y de los protocolos de cultivo . Por ejemplo, si un embrión se obtiene a través de un método de fecundación in vitro, entonces hay una gran posibilidad de que los embriones tengan una alta incidencia de anormalidades cromosómicas postzigóticas que eventualmente pueden dar una calidad pobre de hESCs .
En ratones, las células madre pluripotentes también pueden derivarse del epiblasto de embriones en etapa de post-implantación, comúnmente conocidas como células madre del epiblasto. Estas células madre pluripotentes muestran características de cebado y son altamente dependientes de la activación de las vías de señalización del FGF y la activina para su autorrenovación. En consecuencia, se han definido tres condiciones de pluripotencia distintas, a saber, las condiciones de pluripotencia ingenua, cebada y básica, en ratones.
2. Cultivo de hESCs con o sin células alimentadoras
Una vez recogida la blastómera, normalmente se cocultiva con el embrión parental de la biopsia en un medio que contiene fibronectina y laminina. La adición de laminina en el medio de cultivo es importante para la formación de agregados similares a los de las células madre embrionarias (ESC). Además, hay informes que sugieren que la adición de medios libres de suero y de factores de crecimiento de fibroblastos mejora la proliferación de las células madre y evita que las células madre embrionarias se diferencien. Hemos descrito brevemente varias condiciones de cultivo que se han utilizado para mejorar tanto la calidad como la cantidad de generación de hESCs.
2.1. Células alimentadoras de ratón para cultivar hESCs
Las células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) o células alimentadoras de ratón se consideran los elementos más importantes para las hESCs porque las MEF proporcionan condiciones favorables para el crecimiento y la expansión de las hESCs (Figura 1). Se ha reportado que los MEFs son muy importantes para la generación exitosa de líneas de hESCs . Además, todas las primeras líneas de hESCs se cultivaron en medios que contenían factores de crecimiento y citoquinas secretadas por las células MEF, y estos factores de crecimiento y citoquinas son necesarios para mantener la pluripotencia de las células madre. Como el MEF se derivó de una fuente de ratón, ha planteado serios problemas éticos o de salud para las hESC. Además, el uso de células de origen animal puede transmitir patógenos infecciosos de origen animal a las hESC y hacer que no sean adecuadas para su utilización en humanos. Se ha informado de que las células MEF contienen partículas víricas que son capaces de infectar a las hESC durante el cultivo. Además, algunos investigadores han utilizado suero bovino para cultivar hESCs, pero el uso de suero de origen animal puede transmitir priones y virus animales en el cultivo de células madre embrionarias . Se ha informado de que las células y los sueros de origen animal pueden transmitir virus y otros patógenos a las células madre embrionarias a través de la interacción célula-célula durante el cultivo in vitro . Además, estas moléculas patógenas pueden contaminar todo el cultivo de hESCs. En el caso de que las hESCs estén contaminadas con dichos patógenos, el problema de la contaminación puede persistir incluso si las hESCs se transfieren posteriormente a condiciones de cultivo sin animales. Otro problema de las células alimentadoras de ratón y del suero/proteínas de origen animal es que también contienen ácido siálico no humano (Neu5GC) que también puede suponer un grave problema de contaminación para las hESC. Por ejemplo, se informó de que el ácido siálico derivado de animales entró metabólicamente en la superficie celular de hESCs y contaminó las células madre embrionarias .
2.2. Células alimentadoras no animales para cultivar hESCs
Para evitar los productos de origen animal y las contaminaciones entre especies, los investigadores han desarrollado medios de cultivo que no contienen componentes animales y que al mismo tiempo apoyan el crecimiento y la expansión de las células madre embrionarias. Se ha informado de que se pueden utilizar células humanas para el cultivo de hESC; por ejemplo, se ha informado de que las células de las trompas de Falopio humanas, el prepucio fetal, el músculo y la piel fetales, las células estromales del hígado fetal transgénico, la médula ósea, el cordón umbilical, las células de la placenta y las células del endometrio son compatibles con el cultivo y la expansión de las células madre. Entre estas células humanas, las células estromales del cordón umbilical ofrecen una mejor fuente de células alimentadoras que también pueden ser recogidas utilizando un método no invasivo, mientras que el uso de capas alimentadoras derivadas del prepucio, del feto o de la médula ósea plantea algunas preocupaciones éticas.
Además de las células alimentadoras, las líneas celulares humanas también proporcionan una alternativa a las células alimentadoras de ratón. Recientemente, se derivaron y propagaron varias líneas de hESC utilizando una línea de fibroblastos de prepucio humano disponible en el mercado. Las células endometriales también demostraron ser eficaces para el cultivo in vitro de células madre . Otra forma de eliminar el riesgo de contaminación por patógenos animales es el uso de capas alimentadoras derivadas de la línea de células madre humanas . Se ha demostrado que el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) es producido endógenamente por las células alimentadoras humanas utilizadas en el cultivo de hESC (; Liu et al., 2014). Estas células alimentadoras también secretan TGFβ y activina A, que participan en el mantenimiento de la pluripotencia de las MCI . A pesar de tener varios beneficios, el cultivo de hESC dependiente de células alimentadoras tiene muchas limitaciones; por ejemplo, el mantenimiento de las capas alimentadoras es laborioso con demasiada variación entre las poblaciones de células alimentadoras. Esta disparidad puede afectar negativamente a la demanda de hESC para su aplicación en humanos.
2.3. Cultivo sin alimentador para cultivar hESCs
Como tanto las células alimentadoras animales como las humanas tienen limitaciones, los investigadores han explorado y han diseñado con éxito medios de cultivo químicamente definidos para cultivar hESCs, y lo mejor de los medios definidos es que no contienen células alimentadoras. Uno de los primeros enfoques probados para los medios de crecimiento sin alimentadores fue el uso de proteínas de la matriz extracelular junto con factores de crecimiento para crear una condición de cultivo in vitro para la proliferación y renovación de las células madre (Figura 2). Entre estas proteínas, el Matrigel se utilizó principalmente en combinación con factores de crecimiento o medio condicionado para cultivar hESCs . A pesar de los diversos beneficios, el Matrigel presenta demasiadas variaciones en su composición, lo que plantea problemas para el cultivo de hESCs. El uso de Matrigel también plantea problemas clínicos, ya que se ha informado de que algunos lotes de Matrigel están contaminados con el virus de ARN de ratón monocatenario que eleva la deshidrogenasa láctica . Además de Matrigel, la fibronectina, la laminina y el colágeno tipo IV también han sido buenos candidatos para el cultivo de hESC sin xeno, y las células podrían crecer hasta 20 pasajes . La referencia reportó que la MCI derivada de la placenta humana fue utilizada para cultivar hESCs, y encontraron una fuerte estabilidad genética durante 40 pasajes. Además, las hESCs también se cultivaron en medios de cultivo libres de xeno hasta 80 pasajes.
Sin duda, el uso de medios químicamente definidos junto con proteínas ha mejorado significativamente el cultivo de hESCs. Además, también se utilizaron diferentes proteínas y proteínas recombinantes para mejorar el cultivo de hESCs en condiciones libres de xeno. Entre ellas se encontraban la E-cadherina, la E-cadherina/laminina 521 y los inhibidores de quinasa junto con el bFGF, que se sabe que provocan una sólida proliferación de las células madre en condiciones libres de xeno. También se utilizó una superficie de lecho diseñada sintéticamente para estimular el cultivo de células madre (Melkoumian et al., 2010); por ejemplo, se demostró que la superficie Synthemax de Corning, una superficie sintética de acrilato conjugada con vitronectina, mejoraba no sólo las colonias de hESC sino también la expansión de las células madre (Kawase et al., 2014). Wu et al. describieron recientemente el uso de un nuevo material sintético aislado de proteínas de seda de araña como sustrato adecuado para estimular el cultivo de hESC (Wu et al., 2014). También se ha informado de numerosas superficies sintéticas basadas en polímeros que favorecen el crecimiento y la expansión de las líneas de hESC (Melkoumian et al., 2010; Brafman et al., 2010; Villa-Diazet al., 2013). La lista de diferentes productos químicos utilizados para mejorar el cultivo de hESCs se muestra en la Tabla 2.
|
|||||||||||||||||||||||||||
3. Una de las características más importantes de las células madre embrionarias es que se diferencian en los tres linajes: ectodermo, mesodermo y endodermo (Figura 3). Como las hESCs son células madre pluripotentes, tienen capacidades únicas para diferenciarse en todo tipo de células corporales; por ejemplo, las hESCs pueden diferenciarse en neuronas, células cardíacas, hepatocitos y células musculares. Se ha informado de que las hESCs forman primero cuerpos embrionarios que están básicamente estructurados con tres capas germinales. Estos cuerpos embrionarios están formados por hESCs pluripotentes cultivadas en tres dimensiones (3D) y que expresan marcadores genéticos para las tres capas germinales. Las hESCs pluripotentes tienen una enorme capacidad para diferenciarse (Tabla 3) en células suprarrenales y queratinocitos , células productoras de insulina , células neuronales , células cardíacas , células hepáticas y organoides tipo islote . Algunos factores de crecimiento, como el ácido retinoico y los factores de crecimiento nervioso, se están utilizando para inducir a las hESCs a diferenciarse en neuronas funcionales. Además, se están utilizando algunos factores de crecimiento específicos del linaje para la diferenciación en cardiomiocitos, hepatocitos, músculos esqueléticos, células pancreáticas y células renales. Estas células diferenciadas también se están probando para examinar su funcionalidad tanto en condiciones in vitro como in vivo. Este potencial multilingüe de las hESCs ha demostrado ser vital para la terapia basada en células para tratar diferentes enfermedades degenerativas. Aunque es fácil diferenciar diferentes tipos de células a partir de hESCs, es difícil obtener un gran número de células maduras diferenciadas para aplicaciones terapéuticas . Para obtener células diferenciadas grandes, maduras y funcionales, los medios de cultivo deben contener factores de crecimiento específicos del linaje. También es importante generar grandes cantidades de células a partir de hESCs, ya que son necesarias para el trasplante celular, y esto puede lograrse cultivando las hESCs y las células diferenciadas en un biorreactor en condiciones controladas .
Figura 3
Potencial de multilinaje de las células madre embrionarias humanas: las células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse en tres capas germinales como ectodermo, mesodermo y endodermo.
Nombre de las diferentes células
Células suprarrenales y queratinocitos
Células productoras de insulinacélulas productoras de insulina
Células neuronales
Células cardíacas
Células del hígado
Organoide de tipocomo un organoide
Tabla 3
Capacidades de diferenciación multilingüe de las CME.
4. Prueba de las hESCs utilizando modelos in vitro e in vivo
Después de una diferenciación exitosa de las hESCs en varios tipos de células, el siguiente paso lógico es examinar si las células diferenciadas derivadas tienen alguna funcionalidad o no. La funcionalidad de las células madre y de las células precursoras o maduras diferenciadas se examinó ampliamente tanto en condiciones in vitro como in vivo. La funcionalidad de las neuronas diferenciadas, los cardiomiocitos, los hepatocitos y otros tipos de células se probó en varios modelos animales. Se comprobó que el trasplante de neuronas en el modelo animal de la enfermedad de Parkinson provocaba una recuperación parcial de la función . El trasplante de hESCs y sus células diferenciadas se probó en modelos animales de enfermedades cardiovasculares, accidentes cerebrovasculares, diabetes y lesiones de la médula espinal. Entre los animales, los roedores pequeños, como las ratas y los ratones, han sido una especie de elección para estudiar el trasplante de células. Además, los roedores pequeños son accesibles sin esfuerzo y pueden ser fácilmente manipulados tanto quirúrgica como genéticamente. A pesar de las diversas ventajas de los roedores pequeños, la capacidad de los experimentos con ratones/ratas para predecir la eficacia de la terapia basada en células madre sigue siendo controvertida, ya que muchos modelos de ratones/ratas no representan los fenotipos de las enfermedades humanas. Para superar este problema, los investigadores han empezado a trabajar con animales grandes que se acercan a la anatomía y fisiología humanas. Entre los animales grandes, los perros, las cabras, las ovejas y los primates no humanos se consideran mejores modelos que los ratones o las ratas para las pruebas con células madre. Una de las principales ventajas de utilizar animales grandes es su mayor tiempo de vida, y muchos parámetros anatómicos y fisiológicos son mucho más cercanos a los humanos. Aunque estos modelos animales demuestran la entrega efectiva de las células madre en los tejidos del huésped, todavía no se logra la recuperación funcional y conductual completa. Es necesario seguir investigando para desarrollar modelos animales que se aproximen a la enfermedad humana.
A pesar de este progreso en la investigación con hESC, un reto importante de la terapia celular basada en hESC es el rechazo inmunológico alogénico de las células derivadas de hESC por parte de los receptores . Se descubrió que en una semana, todas las células madre trasplantadas morían debido a la fuerte respuesta inmunitaria del huésped generada en los animales. Para detener la muerte de las células madre trasplantadas, se inyectó a los animales inmunosupresores para suprimir la inmunidad desencadenada por el trasplante de células madre. Sorprendentemente, cuando los animales recibieron inmunosupresores o fármacos como el tacrolimus y el sirolimus, las hESCs sólo pudieron sobrevivir durante 28 días y empezaron a morir a partir de entonces. Aunque no sabemos la razón de ello, la falta de comprensión de la interacción célula-célula podría ser uno de los motivos. Es importante probar las hESCs o las células diferenciadas en condiciones in vitro antes de probarlas en animales. Los modelos in vitro ofrecen mejores oportunidades para estudiar la interacción célula-célula, la migración celular o la integración celular con gran detalle, lo que quizás sea muy difícil de estudiar en los animales. Este problema podría mitigarse gracias a un reciente avance en la tecnología de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) mediante la reprogramación nuclear de células somáticas específicas del paciente con factores definidos, que podrían convertirse en una fuente renovable de células autólogas para la terapia celular. Una de las principales ventajas de las iPSC para la terapia celular humana es que las iPSC específicas del paciente son autólogas y, por lo tanto, se ha asumido que las células derivadas de ellas pueden ser trasplantadas en el mismo paciente sin preocuparse por el rechazo inmunológico . Sin embargo, estudios recientes que revelan la epigenética anormal, la estabilidad genómica y la inmunogenicidad de las iPSC han suscitado preocupaciones sobre la seguridad de la terapia basada en iPSC.
5. Aplicaciones terapéuticas de las hESCs
Como las hESCs son muy prometedoras para los pacientes que sufren enfermedades degenerativas, se han hecho varios intentos para explorar el potencial terapéutico en humanos. El objetivo principal de la terapia basada en células madre es restaurar o reparar las células o tejidos corporales perdidos o dañados. Para que las hESCs sean adecuadas para aplicaciones clínicas, las células madre derivadas deben ser fabricadas de acuerdo con la United States Food Drug Administration (USFDA), las Current Good Manufacturing Practices (cGMP) y las Guidelines for the Clinical Transplantation of Stem Cells, respectivamente. Los productos químicos, los reactivos, las células y las máquinas e instrumentos utilizados en el cultivo de células madre deben someterse a controles de seguridad y salud, y todos los procesos de fabricación deben ser supervisados y documentados según las directrices cGMP. Si analizamos cuántas líneas de hESC utilizadas actualmente cumplen con las directrices de las cGMP, encontraremos que muchas de las líneas de hESC no cumplen con las directrices de las cGMP, porque muchas hESC están expuestas a componentes animales inmunogénicos o patógenos durante sus etapas de aislamiento y propagación. Otra razón por la que no se cumplen las directrices cGMP es que la mayoría de los trabajos de cultivo de hESC se realizan en laboratorios universitarios, en los que muchos de estos laboratorios de investigación no cumplen las directrices cGMP. Hasta ahora, sólo unos pocos investigadores han sido capaces de producir líneas de hESCs de acuerdo con las directrices cGMP.
Considerando los potenciales beneficios comerciales de las hESCs, algunas empresas de biotecnología también han participado en la financiación de la investigación con células madre con el único objetivo de comercializar productos con células madre. Estas empresas han comenzado a fabricar hESCs en condiciones cGMP y han empezado a probar las células madre en un entorno clínico. En 2009, Geron Corporation (empresa de biotecnología con sede en California) solicitó a la FDA el inicio de su primer ensayo clínico con células derivadas de hESCs. El ensayo clínico se inició en octubre de 2010, y en él se inyectaron 1,5 millones de células precursoras de oligodendrocitos derivadas de hESCs a tres pacientes que sufrían una lesión medular. El ensayo se interrumpió de forma inesperada y desconocemos el motivo, probablemente porque los resultados preliminares del ensayo mostraron que las células derivadas de hESCs no produjeron ninguna mejora apreciable en la lesión medular. Además, la FDA también aprobó otro ensayo para el uso de hESCs en la enfermedad de degeneración macular . Otra empresa, Advanced Cell Technology, situada en Marlborough (Massachusetts), inició ensayos clínicos con hESC. Las células se inyectaron en pacientes que padecían distrofia muscular de Stargardt y degeneración macular seca relacionada con la edad. Se utilizaron células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivadas de hESCs . En el estudio, se administraron células RPE en los pacientes y, tras 4 meses de postrasplante, se comprobó que los pacientes mostraban pequeñas mejoras en la función visual sin ningún indicio de rechazo inmunitario ni signo alguno de formación de teratomas . También se probaron las células madre en pacientes con diabetes de tipo I, a los que se administraron células precursoras pancreáticas.
6. Resumen y conclusión
Las células madre embrionarias humanas tienen un gran potencial terapéutico para el tratamiento de diversas enfermedades como el cáncer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la diabetes. Tanto los estudios in vitro como los in vivo sugieren que todavía hay esperanzas de que las futuras células madre embrionarias proporcionen curas para diversas enfermedades. Pero el éxito de la terapia basada en células madre depende de la disponibilidad de células maduras y funcionales. Para obtener células maduras y funcionales, sería mejor que las células madre se cultivaran en condiciones tridimensionales (3D). La mayoría de las líneas de hESC se obtienen mediante condiciones de cultivo bidimensionales (2D). El uso del cultivo en 2D tiene algunas limitaciones, ya que las hESCs que han crecido en condiciones 2D no representan las células humanas del cuerpo humano y la mayoría de las hESCs cultivadas en 2D mueren inmediatamente después del trasplante celular; las células que sobreviven siguen sin reparar los tejidos del cuerpo. Este problema puede solucionarse cultivando las hESC en condiciones 3D, donde las células pueden crecer en tres direcciones y las posibilidades de supervivencia de las células aumentarán tras el trasplante. Otro punto importante a tener en cuenta para el éxito de una terapia basada en células madre es evaluar rigurosamente las células derivadas de células madre en modelos animales antes de probarlas en humanos. La integración célula-célula, la comunicación célula-célula, la migración celular y la funcionalidad celular deben ser evaluadas a fondo en modelos animales utilizando enfoques de ensayo tanto a corto como a largo plazo. La cuestión relacionada con la formación de traumatismos y la inmunorrechazo también debe resolverse mediante el desarrollo de líneas de células madre que no causen inmunorrechazo y no formen tumores tras el trasplante. Esto puede lograrse silenciando las vías genéticas/moleculares que desencadenan la formación de tumores y la inmunorrechazo, respectivamente. Además, la terapia celular también requiere muchas células maduras, por lo que los esfuerzos también deben dirigirse al aislamiento de una gran cantidad de células madre y sus precursores, aportando un nuevo enfoque y metodología innovadores. Por último, las células madre embrionarias humanas siguen siendo muy prometedoras para el tratamiento de diversas enfermedades degenerativas, así como para aplicaciones de diagnóstico.
Conflictos de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Contribuciones de los autores
Este manuscrito ha sido aprobado por todos los autores para su presentación.
Agradecimientos
Los autores agradecen a toda la dirección del Instituto de Investigación y Consultas Médicas (IMRC), Universidad Imam Abdulrahman Bin Faisal, Dammam, Reino de Arabia Saudí, por su apoyo y estímulo.
|
|||||||||||||||||||||
4. Prueba de las hESCs utilizando modelos in vitro e in vivo
Después de una diferenciación exitosa de las hESCs en varios tipos de células, el siguiente paso lógico es examinar si las células diferenciadas derivadas tienen alguna funcionalidad o no. La funcionalidad de las células madre y de las células precursoras o maduras diferenciadas se examinó ampliamente tanto en condiciones in vitro como in vivo. La funcionalidad de las neuronas diferenciadas, los cardiomiocitos, los hepatocitos y otros tipos de células se probó en varios modelos animales. Se comprobó que el trasplante de neuronas en el modelo animal de la enfermedad de Parkinson provocaba una recuperación parcial de la función . El trasplante de hESCs y sus células diferenciadas se probó en modelos animales de enfermedades cardiovasculares, accidentes cerebrovasculares, diabetes y lesiones de la médula espinal. Entre los animales, los roedores pequeños, como las ratas y los ratones, han sido una especie de elección para estudiar el trasplante de células. Además, los roedores pequeños son accesibles sin esfuerzo y pueden ser fácilmente manipulados tanto quirúrgica como genéticamente. A pesar de las diversas ventajas de los roedores pequeños, la capacidad de los experimentos con ratones/ratas para predecir la eficacia de la terapia basada en células madre sigue siendo controvertida, ya que muchos modelos de ratones/ratas no representan los fenotipos de las enfermedades humanas. Para superar este problema, los investigadores han empezado a trabajar con animales grandes que se acercan a la anatomía y fisiología humanas. Entre los animales grandes, los perros, las cabras, las ovejas y los primates no humanos se consideran mejores modelos que los ratones o las ratas para las pruebas con células madre. Una de las principales ventajas de utilizar animales grandes es su mayor tiempo de vida, y muchos parámetros anatómicos y fisiológicos son mucho más cercanos a los humanos. Aunque estos modelos animales demuestran la entrega efectiva de las células madre en los tejidos del huésped, todavía no se logra la recuperación funcional y conductual completa. Es necesario seguir investigando para desarrollar modelos animales que se aproximen a la enfermedad humana.
A pesar de este progreso en la investigación con hESC, un reto importante de la terapia celular basada en hESC es el rechazo inmunológico alogénico de las células derivadas de hESC por parte de los receptores . Se descubrió que en una semana, todas las células madre trasplantadas morían debido a la fuerte respuesta inmunitaria del huésped generada en los animales. Para detener la muerte de las células madre trasplantadas, se inyectó a los animales inmunosupresores para suprimir la inmunidad desencadenada por el trasplante de células madre. Sorprendentemente, cuando los animales recibieron inmunosupresores o fármacos como el tacrolimus y el sirolimus, las hESCs sólo pudieron sobrevivir durante 28 días y empezaron a morir a partir de entonces. Aunque no sabemos la razón de ello, la falta de comprensión de la interacción célula-célula podría ser uno de los motivos. Es importante probar las hESCs o las células diferenciadas en condiciones in vitro antes de probarlas en animales. Los modelos in vitro ofrecen mejores oportunidades para estudiar la interacción célula-célula, la migración celular o la integración celular con gran detalle, lo que quizás sea muy difícil de estudiar en los animales. Este problema podría mitigarse gracias a un reciente avance en la tecnología de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) mediante la reprogramación nuclear de células somáticas específicas del paciente con factores definidos, que podrían convertirse en una fuente renovable de células autólogas para la terapia celular. Una de las principales ventajas de las iPSC para la terapia celular humana es que las iPSC específicas del paciente son autólogas y, por lo tanto, se ha asumido que las células derivadas de ellas pueden ser trasplantadas en el mismo paciente sin preocuparse por el rechazo inmunológico . Sin embargo, estudios recientes que revelan la epigenética anormal, la estabilidad genómica y la inmunogenicidad de las iPSC han suscitado preocupaciones sobre la seguridad de la terapia basada en iPSC.
5. Aplicaciones terapéuticas de las hESCs
Como las hESCs son muy prometedoras para los pacientes que sufren enfermedades degenerativas, se han hecho varios intentos para explorar el potencial terapéutico en humanos. El objetivo principal de la terapia basada en células madre es restaurar o reparar las células o tejidos corporales perdidos o dañados. Para que las hESCs sean adecuadas para aplicaciones clínicas, las células madre derivadas deben ser fabricadas de acuerdo con la United States Food Drug Administration (USFDA), las Current Good Manufacturing Practices (cGMP) y las Guidelines for the Clinical Transplantation of Stem Cells, respectivamente. Los productos químicos, los reactivos, las células y las máquinas e instrumentos utilizados en el cultivo de células madre deben someterse a controles de seguridad y salud, y todos los procesos de fabricación deben ser supervisados y documentados según las directrices cGMP. Si analizamos cuántas líneas de hESC utilizadas actualmente cumplen con las directrices de las cGMP, encontraremos que muchas de las líneas de hESC no cumplen con las directrices de las cGMP, porque muchas hESC están expuestas a componentes animales inmunogénicos o patógenos durante sus etapas de aislamiento y propagación. Otra razón por la que no se cumplen las directrices cGMP es que la mayoría de los trabajos de cultivo de hESC se realizan en laboratorios universitarios, en los que muchos de estos laboratorios de investigación no cumplen las directrices cGMP. Hasta ahora, sólo unos pocos investigadores han sido capaces de producir líneas de hESCs de acuerdo con las directrices cGMP.
Considerando los potenciales beneficios comerciales de las hESCs, algunas empresas de biotecnología también han participado en la financiación de la investigación con células madre con el único objetivo de comercializar productos con células madre. Estas empresas han comenzado a fabricar hESCs en condiciones cGMP y han empezado a probar las células madre en un entorno clínico. En 2009, Geron Corporation (empresa de biotecnología con sede en California) solicitó a la FDA el inicio de su primer ensayo clínico con células derivadas de hESCs. El ensayo clínico se inició en octubre de 2010, y en él se inyectaron 1,5 millones de células precursoras de oligodendrocitos derivadas de hESCs a tres pacientes que sufrían una lesión medular. El ensayo se interrumpió de forma inesperada y desconocemos el motivo, probablemente porque los resultados preliminares del ensayo mostraron que las células derivadas de hESCs no produjeron ninguna mejora apreciable en la lesión medular. Además, la FDA también aprobó otro ensayo para el uso de hESCs en la enfermedad de degeneración macular . Otra empresa, Advanced Cell Technology, situada en Marlborough (Massachusetts), inició ensayos clínicos con hESC. Las células se inyectaron en pacientes que padecían distrofia muscular de Stargardt y degeneración macular seca relacionada con la edad. Se utilizaron células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivadas de hESCs . En el estudio, se administraron células RPE en los pacientes y, tras 4 meses de postrasplante, se comprobó que los pacientes mostraban pequeñas mejoras en la función visual sin ningún indicio de rechazo inmunitario ni signo alguno de formación de teratomas . También se probaron las células madre en pacientes con diabetes de tipo I, a los que se administraron células precursoras pancreáticas.
6. Resumen y conclusión
Las células madre embrionarias humanas tienen un gran potencial terapéutico para el tratamiento de diversas enfermedades como el cáncer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la diabetes. Tanto los estudios in vitro como los in vivo sugieren que todavía hay esperanzas de que las futuras células madre embrionarias proporcionen curas para diversas enfermedades. Pero el éxito de la terapia basada en células madre depende de la disponibilidad de células maduras y funcionales. Para obtener células maduras y funcionales, sería mejor que las células madre se cultivaran en condiciones tridimensionales (3D). La mayoría de las líneas de hESC se obtienen mediante condiciones de cultivo bidimensionales (2D). El uso del cultivo en 2D tiene algunas limitaciones, ya que las hESCs que han crecido en condiciones 2D no representan las células humanas del cuerpo humano y la mayoría de las hESCs cultivadas en 2D mueren inmediatamente después del trasplante celular; las células que sobreviven siguen sin reparar los tejidos del cuerpo. Este problema puede solucionarse cultivando las hESC en condiciones 3D, donde las células pueden crecer en tres direcciones y las posibilidades de supervivencia de las células aumentarán tras el trasplante. Otro punto importante a tener en cuenta para el éxito de una terapia basada en células madre es evaluar rigurosamente las células derivadas de células madre en modelos animales antes de probarlas en humanos. La integración célula-célula, la comunicación célula-célula, la migración celular y la funcionalidad celular deben ser evaluadas a fondo en modelos animales utilizando enfoques de ensayo tanto a corto como a largo plazo. La cuestión relacionada con la formación de traumatismos y la inmunorrechazo también debe resolverse mediante el desarrollo de líneas de células madre que no causen inmunorrechazo y no formen tumores tras el trasplante. Esto puede lograrse silenciando las vías genéticas/moleculares que desencadenan la formación de tumores y la inmunorrechazo, respectivamente. Además, la terapia celular también requiere muchas células maduras, por lo que los esfuerzos también deben dirigirse al aislamiento de una gran cantidad de células madre y sus precursores, aportando un nuevo enfoque y metodología innovadores. Por último, las células madre embrionarias humanas siguen siendo muy prometedoras para el tratamiento de diversas enfermedades degenerativas, así como para aplicaciones de diagnóstico.
Conflictos de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Contribuciones de los autores
Este manuscrito ha sido aprobado por todos los autores para su presentación.
Agradecimientos
Los autores agradecen a toda la dirección del Instituto de Investigación y Consultas Médicas (IMRC), Universidad Imam Abdulrahman Bin Faisal, Dammam, Reino de Arabia Saudí, por su apoyo y estímulo.